Kvantitativ 3D-avbildning av trypanosoma cruzi-infekterade celler, vilande amastigotes och T-celler i intakta klarade organ
Summary
Detta protokoll beskriver ljusark fluorescerande mikroskopi och automatiserade mjukvaruassisterade metoder för att visualisera och exakt kvantifiera prolifererande och vilande Trypanosoma cruzi-parasiter och T-celler i intakta, rensade organ och vävnader. Dessa tekniker ger ett tillförlitligt sätt att utvärdera behandlingsresultat och erbjuda nya insikter i parasit-värdinteraktioner.
Abstract
Chagas sjukdom är en försummad patologi som drabbar miljontals människor världen över, främst i Latinamerika. Chagas sjukdomsmedel, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), är en obligatorisk intracellulär parasit med en mångsidig biologi som infekterar flera däggdjursarter, inklusive människor, vilket orsakar hjärt- och matsmältningspatologier. Tillförlitlig detektion av T. cruzi in vivo-infektioner har länge behövts för att förstå Chagas sjukdoms komplexa biologi och noggrant utvärdera resultatet av behandlingsregimer. Det nuvarande protokollet visar en integrerad pipeline för automatiserad kvantifiering av T. cruzi-infekterade celler i 3D-rekonstruerade, rensade organ. Ljusark fluorescerande mikroskopi möjliggör exakt visualisering och kvantifiering av aktivt prolifererande och vilande T. cruzi-parasiter och immuneffektorceller i hela organ eller vävnader. Dessutom antogs CUBIC-HistoVision-rörledningen för att erhålla enhetlig märkning av rensade organ med antikroppar och kärnfläckar. Vävnadsrensning i kombination med 3D-immunfärgning ger ett opartiskt tillvägagångssätt för att omfattande utvärdera läkemedelsbehandlingsprotokoll, förbättra förståelsen för den cellulära organisationen av T. cruzi-infekterade vävnader och förväntas främja upptäckter relaterade till anti-T. cruzi-immunsvar, vävnadsskada och reparation vid Chagas sjukdom.
Introduction
Chagas sjukdom, orsakad av protozoparasiten T. cruzi, är bland världens mest försummade tropiska sjukdomar och orsakar cirka 13 000 årliga dödsfall. Infektionen fortskrider ofta från ett akut till ett kroniskt stadium som producerar hjärtpatologi hos 30% av patienterna, inklusive arytmier, hjärtsvikt och plötslig död 1,2. Trots det starka värdimmunsvaret som framkallas mot parasiten under den akuta fasen, kvarstår ett lågt antal parasiter kroniskt under värdens liv i vävnader som hjärtat och skelettmuskeln. Flera faktorer, inklusive den fördröjda uppkomsten av adaptiva immunsvar och närvaron av icke-replikerande former av parasiten, kan bidra till kapaciteten hos T. cruzi att undvika en fullständig eliminering av immunsystemet 3,4,5,6. Dessutom uppvisar icke-replikerande vilande former av parasiten en låg mottaglighet för trypanocidala läkemedel och kan delvis vara ansvariga för det behandlingsmisslyckande som observerats i många fall 7,8.
Utvecklingen av nya avbildningstekniker ger en möjlighet att få insikt i den rumsliga fördelningen av parasiterna i de infekterade vävnaderna och deras förhållande till immuncellerna som är involverade i deras kontroll. Dessa egenskaper är avgörande för en bättre förståelse av processerna för parasitkontroll av immunsystemet och spårning av de sällsynta vilande parasiterna som finns i kroniska vävnader.
Light-sheet fluorescensmikroskopi (LSFM) är en av de mest omfattande och opartiska metoderna för 3D-avbildning av stora vävnader eller organ utan tunnsektion. Ljusarkmikroskop använder ett tunt ljusark för att bara excitera fluoroforerna i fokalplanet, minska fotoblekning och fototoxicitet hos prover och spela in bilder av tusentals vävnadsskikt med ultrasnabba kameror. Den höga nivån av vävnadstransparens som är nödvändig för korrekt penetrering av laserljuset i vävnader erhålls genom homogenisering av brytningsindexet (RI) efter vävnadsavfettning och avfärgning, vilket minskar spridningen av ljus och ger högkvalitativa bilder 9,10,11.
Vävnadsrensningsmetoder har utvecklats för avbildning av hela möss 12,13,14, organoider 15,16,17, organ som uttrycker reporterfluorescerande markörer 18,19,20,21,22,23 och nyligen ett begränsat antal mänskliga vävnader 24 . De nuvarande metoderna för vävnadsrensning klassificeras i tre familjer: (1) organiska lösningsmedelsbaserade metoder som DISCO-protokoll 25,26, (2) hydrogelbaserade metoder, såsom CLARITY27, och vattenhaltiga metoder, såsom CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . KUBISKA protokoll upprätthåller organform och vävnadsintegritet och bevarar fluorescensen hos endogent uttryckta reporterproteiner. Den senaste uppdateringen av denna teknik, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), tillåter också detektion av epitoper med hjälp av fluorescerande märkta antikroppar och DNA-märkning28.
I detta protokoll användes CUBIC-rörledningen för detektion av T. cruzi som uttrycker fluorescerande proteiner i klargjorda intakta musvävnader. Optiskt transparenta vävnader avbildades LSFM, 3D-rekonstruerades och det exakta totala antalet T. cruzi-infekterade celler, vilande amastigotes och T-celler per organ kvantifierades automatiskt. Även detta protokoll antogs framgångsrikt för att erhålla enhetlig märkning av rensade organ med antikroppar och kärnfläckar. Dessa tillvägagångssätt är viktiga för att förstå expansionen och kontrollen av T. cruzi hos infekterade värdar och är användbara för att fullt ut utvärdera kemo- och immunterapier för Chagas sjukdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Frånvaron av omfattande helorgansavbildning av parasiter och immunsvaret begränsar förståelsen av komplexiteten i värd-parasitinteraktionerna och hindrar utvärderingen av terapier för Chagas sjukdom. Den aktuella studien antog CUBIC-rörledningen för att klargöra och fläcka intakta organ och vävnader hos T. cruzi-infekterade möss.
Flera vävnadsrensningsprotokoll testades i denna studie (PACT32, ECi 33, FLASH34, iDISCO 1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Etsuo Susaki för deras värdefulla hjälp och rekommendationer angående vävnadsrensning och immunfärgningsprotokoll. Vi är också tacksamma mot M. Kandasamy från CTEGD Biomedical Microscopy Core för teknisk support med LSFM och konfokal avbildning. Vi tackar också alla medlemmar i Tarleton Research Group för användbara förslag under hela denna studie.
Materials
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
- Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
- Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
- Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
- Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
- Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
- Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
- Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
- Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
- Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).
