Imagerie 3D quantitative de cellules infectées par Trypanosoma cruzi, d’amastigotes dormants et de cellules T dans des organes clarifiés intacts
Summary
Le présent protocole décrit la microscopie fluorescente à feuille de lumière et les méthodes automatisées assistées par logiciel pour visualiser et quantifier avec précision la prolifération et la dormance des parasites Trypanosoma cruzi et des lymphocytes T dans des organes et des tissus intacts et nettoyés. Ces techniques fournissent un moyen fiable d’évaluer les résultats du traitement et offrent de nouvelles perspectives sur les interactions parasite-hôte.
Abstract
La maladie de Chagas est une pathologie négligée qui touche des millions de personnes dans le monde, principalement en Amérique latine. L’agent de la maladie de Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), est un parasite intracellulaire obligatoire avec une biologie diversifiée qui infecte plusieurs espèces de mammifères, y compris les humains, provoquant des pathologies cardiaques et digestives. Une détection fiable des infections in vivo à T. cruzi est nécessaire depuis longtemps pour comprendre la biologie complexe de la maladie de Chagas et évaluer avec précision les résultats des schémas thérapeutiques. Le protocole actuel démontre un pipeline intégré pour la quantification automatisée des cellules infectées par T. cruzi dans des organes reconstruits en 3D. La microscopie fluorescente à feuille de lumière permet de visualiser et de quantifier avec précision les parasites T. cruzi proliférants et dormants et les cellules effectrices immunitaires dans des organes ou des tissus entiers. En outre, le pipeline CUBIC-HistoVision pour obtenir un marquage uniforme des organes dégagés avec des anticorps et des colorations nucléaires a été adopté avec succès. Le nettoyage des tissus, associé à l’immunomarquage 3D, fournit une approche impartiale pour évaluer de manière exhaustive les protocoles de traitement médicamenteux, améliorer la compréhension de l’organisation cellulaire des tissus infectés par T. cruzi et devrait faire progresser les découvertes liées aux réponses immunitaires anti-T. cruzi , aux lésions tissulaires et à la réparation dans la maladie de Chagas.
Introduction
La maladie de Chagas, causée par le parasite protozoaire T. cruzi, est l’une des maladies tropicales les plus négligées au monde, causant environ 13 000 décès annuels. L’infection progresse souvent d’un stade aigu à un stade chronique produisant une pathologie cardiaque chez 30% des patients, y compris des arythmies, une insuffisance cardiaque et une mort subite 1,2. Malgré la forte réponse immunitaire de l’hôte provoquée contre le parasite pendant la phase aiguë, un faible nombre de parasites persiste de façon chronique tout au long de la vie de l’hôte dans des tissus tels que le cœur et les muscles squelettiques. Plusieurs facteurs, dont l’apparition tardive de réponses immunitaires adaptatives et la présence de formes non réplicatives du parasite, peuvent contribuer à la capacité de T. cruzi d’éviter une élimination complète par le système immunitaire 3,4,5,6. De plus, les formes dormantes non réplicatives du parasite présentent une faible sensibilité aux médicaments trypanocides et peuvent en partie être responsables de l’échec du traitement observé dans de nombreux cas 7,8.
Le développement de nouvelles techniques d’imagerie permet de mieux comprendre la distribution spatiale des parasites dans les tissus infectés et leur relation avec les cellules immunitaires impliquées dans leur contrôle. Ces caractéristiques sont cruciales pour une meilleure compréhension des processus de contrôle des parasites par le système immunitaire et le suivi des rares parasites dormants présents dans les tissus chroniques.
La microscopie à fluorescence à feuille de lumière (LSFM) est l’une des méthodes les plus complètes et les plus impartiales pour l’imagerie 3D de grands tissus ou organes sans coupe mince. Les microscopes à feuille de lumière utilisent une fine feuille de lumière pour exciter uniquement les fluorophores dans le plan focal, réduire le photoblanchiment et la phototoxicité des échantillons et enregistrer des images de milliers de couches tissulaires à l’aide de caméras ultra-rapides. Le haut niveau de transparence tissulaire nécessaire à la bonne pénétration de la lumière laser dans les tissus est obtenu en homogénéisant l’indice de réfraction (IR) suite à la délipidation et à la décoloration des tissus, ce qui réduit la diffusion de la lumière et rend des images de haute qualité 9,10,11.
Des approches de nettoyage tissulaire ont été développées pour l’imagerie de souris entières 12,13,14, d’organoïdes 15,16,17, d’organes exprimant des marqueurs fluorescents rapporteurs 18,19,20,21,22,23 et, récemment, d’un nombre limité de tissus humains 24 . Les méthodes actuelles de nettoyage tissulaire sont classées en trois familles : (1) les méthodes à base de solvants organiques telles que les protocoles DISCO 25,26, (2) les méthodes à base d’hydrogel, telles que CLARITY27, et les méthodes aqueuses, telles que CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . Les protocoles CUBIC maintiennent la forme des organes et l’intégrité des tissus, préservant la fluorescence des protéines rapporteures exprimées de manière endogène. La mise à jour la plus récente de cette technique, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), permet également la détection d’épitopes à l’aide d’anticorps marqués par fluorescence et de marquage ADN28.
Dans le présent protocole, le pipeline CUBIC pour détecter T. cruzi exprimant des protéines fluorescentes dans des tissus de souris intacts clarifiés a été utilisé. Des tissus optiquement transparents ont été imagés LSFM, reconstruits en 3D et le nombre total précis de cellules infectées par T. cruzi , d’amastigotes dormants et de cellules T par organe a été automatiquement quantifié. En outre, ce protocole a été adopté avec succès pour obtenir un marquage uniforme des organes nettoyés avec des anticorps et des colorations nucléaires. Ces approches sont essentielles pour comprendre l’expansion et le contrôle de T. cruzi chez les hôtes infectés et sont utiles pour évaluer pleinement les chimiothérapies et immunothérapeutiques pour la maladie de Chagas.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’absence d’imagerie approfondie des parasites et de la réponse immunitaire limite la compréhension de la complexité des interactions hôte-parasite et entrave l’évaluation des thérapies pour la maladie de Chagas. La présente étude a adopté le pipeline CUBIC pour clarifier et colorer les organes et tissus intacts de souris infectées par T. cruzi.
Plusieurs protocoles de nettoyage tissulaire ont été testés dans cette étude (PACT32, ECi 33, FLA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Etsuo Susaki pour son aide précieuse et ses recommandations concernant les protocoles de nettoyage tissulaire et d’immunomarquage. De plus, nous sommes reconnaissants à M. Kandasamy du noyau de microscopie biomédicale du CTEGD pour son soutien technique à l’aide de LSFM et de l’imagerie confocale. Nous remercions également tous les membres du Tarleton Research Group pour leurs suggestions utiles tout au long de cette étude.
Materials
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
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