Quantitative 3D-Bildgebung von Trypanosoma-cruzi-infizierten Zellen, ruhenden Amastigoten und T-Zellen in intakten geklärten Organen
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie und automatisierte softwaregestützte Methoden zur Visualisierung und genauen Quantifizierung proliferierender und ruhender Trypanosoma-cruzi-Parasiten und T-Zellen in intakten, gereinigten Organen und Geweben. Diese Techniken bieten eine zuverlässige Möglichkeit, Behandlungsergebnisse zu bewerten und neue Einblicke in Parasiten-Wirt-Interaktionen zu bieten.
Abstract
Die Chagas-Krankheit ist eine vernachlässigte Pathologie, die Millionen von Menschen weltweit betrifft, hauptsächlich in Lateinamerika. Der Erreger der Chagas-Krankheit, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), ist ein obligater intrazellulärer Parasit mit einer vielfältigen Biologie, der mehrere Säugetierarten, einschließlich des Menschen, infiziert und Herz- und Verdauungspathologien verursacht. Der zuverlässige Nachweis von T. cruzi-In-vivo-Infektionen ist seit langem erforderlich, um die komplexe Biologie der Chagas-Krankheit zu verstehen und das Ergebnis von Behandlungsschemata genau zu bewerten. Das aktuelle Protokoll demonstriert eine integrierte Pipeline zur automatisierten Quantifizierung von T. cruzi-infizierten Zellen in 3D-rekonstruierten, geklärten Organen. Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die genaue Visualisierung und Quantifizierung von aktiv proliferierenden und ruhenden T. cruzi-Parasiten und Immuneffektorzellen in ganzen Organen oder Geweben. Auch die CUBIC-HistoVision-Pipeline zur einheitlichen Markierung von befreiten Organen mit Antikörpern und nuklearen Färbungen wurde erfolgreich übernommen. Die Gewebereinigung in Verbindung mit der 3D-Immunfärbung bietet einen unvoreingenommenen Ansatz zur umfassenden Bewertung von Arzneimittelbehandlungsprotokollen, zur Verbesserung des Verständnisses der zellulären Organisation von T. cruzi-infizierten Geweben und soll Entdeckungen im Zusammenhang mit Anti-T-Cruzi-Immunantworten, Gewebeschäden und Reparaturen bei der Chagas-Krankheit vorantreiben.
Introduction
Die Chagas-Krankheit, verursacht durch den Protozoenparasiten T. cruzi, gehört zu den am meisten vernachlässigten Tropenkrankheiten der Welt und verursacht jährlich etwa 13.000 Todesfälle. Die Infektion schreitet häufig von einem akuten zu einem chronischen Stadium fort, was bei 30% der Patienten zu einer Herzpathologie führt, einschließlich Arrhythmien, Herzinsuffizienz und plötzlichem Tod 1,2. Trotz der starken Immunantwort des Wirts gegen den Parasiten während der akuten Phase bleiben während des gesamten Lebens des Wirts eine geringe Anzahl von Parasiten in Geweben wie Herz und Skelettmuskulatur chronisch bestehen. Mehrere Faktoren, einschließlich des verzögerten Einsetzens adaptiver Immunantworten und des Vorhandenseins nicht replizierender Formen des Parasiten, können dazu beitragen, dass T. cruzi eine vollständige Eliminierung durch das Immunsystem vermeidenkann 3,4,5,6. Darüber hinaus zeigen nicht-replizierende ruhende Formen des Parasiten eine geringe Anfälligkeit für trypanocide Medikamente und können teilweise für das in vielen Fällen beobachtete Behandlungsversagen verantwortlich sein 7,8.
Die Entwicklung neuer bildgebender Verfahren bietet die Möglichkeit, Einblicke in die räumliche Verteilung der Parasiten in den infizierten Geweben und ihre Beziehung zu den an ihrer Bekämpfung beteiligten Immunzellen zu gewinnen. Diese Eigenschaften sind entscheidend für ein besseres Verständnis der Prozesse der Parasitenkontrolle durch das Immunsystem und die Verfolgung der seltenen schlafenden Parasiten, die in chronischen Geweben vorhanden sind.
Die Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) ist eine der umfassendsten und unvoreingenommensten Methoden zur 3D-Bildgebung großer Gewebe oder Organe ohne Dünnschnitt. Lichtblattmikroskope verwenden eine dünne Lichtschicht, um nur die Fluorophore in der Fokusebene anzuregen, Photobleiche und Phototoxizität von Proben zu reduzieren und Bilder von Tausenden von Gewebeschichten mit ultraschnellen Kameras aufzunehmen. Die hohe Gewebetransparenz, die für das ordnungsgemäße Eindringen des Laserlichts in Gewebe erforderlich ist, wird durch Homogenisierung des Brechungsindex (RI) nach Gewebeentfettung und -entfärbung erreicht, wodurch die Lichtstreuung reduziert und qualitativ hochwertige Bilder erzeugtwerden 9,10,11.
Gewebereinigungsansätze wurden für die Bildgebung ganzer Mäuse 12,13,14, Organoide 15,16,17, Organe, die Reporterfluoreszenzmarker exprimieren, 18,19,20,21,22,23 und kürzlich einer begrenzten Anzahl menschlicher Gewebe entwickelt 24 . Die derzeitigen Methoden zur Gewebereinigung werden in drei Familien eingeteilt: (1) organische lösungsmittelbasierte Methoden wie die DISCO-Protokolle 25,26, (2) Hydrogel-basierte Methoden wie CLARITY27 und wässrige Methoden wie CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . CUBIC-Protokolle erhalten Organform und Gewebeintegrität und bewahren die Fluoreszenz endogen exprimierter Reporterproteine. Die neueste Aktualisierung dieser Technik, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), erlaubt auch den Nachweis von Epitopen mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper und DNA-Markierung28.
Im vorliegenden Protokoll wurde die CUBIC-Pipeline zum Nachweis von T. cruzi exprimierenden fluoreszierenden Proteinen in geklärten intakten Mausgeweben verwendet. Optisch transparente Gewebe wurden LSFM abgebildet, 3D rekonstruiert und die genaue Gesamtzahl der T. cruzi-infizierten Zellen, ruhenden Amastigoten und T-Zellen pro Organ automatisch quantifiziert. Dieses Protokoll wurde auch erfolgreich übernommen, um eine einheitliche Kennzeichnung von gereinigten Organen mit Antikörpern und nukleären Färbungen zu erhalten. Diese Ansätze sind essentiell für das Verständnis der Expansion und Kontrolle von T. cruzi in infizierten Wirten und sind nützlich für die vollständige Bewertung von Chemo- und Immuntherapeutika für die Chagas-Krankheit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Fehlen einer umfassenden Ganzorgan-Bildgebung von Parasiten und der Immunantwort schränkt das Verständnis der Komplexität der Wirt-Parasit-Interaktionen ein und behindert die Bewertung von Therapien für die Chagas-Krankheit. Die vorliegende Studie übernahm die CUBIC-Pipeline, um intakte Organe und Gewebe von T. cruzi-infizierten Mäusen zu klären und zu färben.
In dieser Studie wurden mehrere Gewebereinigungsprotokolle getestet (PACT32, ECi 33, FLASH…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Etsuo Susaki für ihre wertvolle Hilfe und Empfehlungen zu Protokollen zur Gewebereinigung und Immunfärbung. Außerdem danken wir M. Kandasamy vom CTEGD Biomedical Microscopy Core für die technische Unterstützung mit LSFM und konfokaler Bildgebung. Wir danken auch allen Mitgliedern der Tarleton Research Group für hilfreiche Vorschläge während dieser Studie.
Materials
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
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