ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी-संक्रमित कोशिकाओं, निष्क्रिय अमास्टिगोट्स और बरकरार स्पष्ट अंगों में टी कोशिकाओं की मात्रात्मक 3 डी इमेजिंग
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल प्रकाश शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और स्वचालित सॉफ्टवेयर सहायता प्राप्त तरीकों का वर्णन करता है ताकि बरकरार, साफ अंगों और ऊतकों में प्रसार और निष्क्रिय ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी परजीवी और टी कोशिकाओं की कल्पना और सटीक मात्रा निर्धारित की जा सके। ये तकनीकें उपचार के परिणामों का मूल्यांकन करने और परजीवी-मेजबान इंटरैक्शन में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने का एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करती हैं।
Abstract
चगास रोग एक उपेक्षित विकृति है जो दुनिया भर में लाखों लोगों को प्रभावित करती है, मुख्य रूप से लैटिन अमेरिका में। चागास रोग एजेंट, ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी (टी क्रूज़ी), एक विविध जीव विज्ञान के साथ एक अनिवार्य इंट्रासेल्युलर परजीवी है जो मनुष्यों सहित कई स्तनधारी प्रजातियों को संक्रमित करता है, जिससे हृदय और पाचन विकृति होती है। विवो संक्रमण में टी क्रूज़ी का विश्वसनीय पता लगाने के लिए लंबे समय से चागास रोग के जटिल जीव विज्ञान को समझने और उपचार आहार के परिणाम का सटीक मूल्यांकन करने की आवश्यकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल 3 डी-पुनर्निर्माण, साफ अंगों में टी क्रूज़ी-संक्रमित कोशिकाओं के स्वचालित परिमाणीकरण के लिए एक एकीकृत पाइपलाइन प्रदर्शित करता है। लाइट-शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी पूरे अंगों या ऊतकों में सक्रिय रूप से प्रसार और निष्क्रिय टी क्रूज़ी परजीवी और प्रतिरक्षा प्रभावकारी कोशिकाओं की सटीक कल्पना और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, एंटीबॉडी और परमाणु दाग के साथ साफ किए गए अंगों की समान लेबलिंग प्राप्त करने के लिए क्यूबिक-हिस्टोविजन पाइपलाइन को सफलतापूर्वक अपनाया गया था। 3 डी इम्यूनोस्टेनिंग के साथ मिलकर ऊतक समाशोधन दवा उपचार प्रोटोकॉल का व्यापक रूप से मूल्यांकन करने, टी क्रूज़ी-संक्रमित ऊतकों के सेलुलर संगठन की समझ में सुधार करने के लिए एक निष्पक्ष दृष्टिकोण प्रदान करता है, और एंटी-टी क्रूज़ी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, ऊतक क्षति और चागास रोग में मरम्मत से संबंधित खोजों को आगे बढ़ाने की उम्मीद है।
Introduction
प्रोटोजोआ परजीवी टी क्रूज़ी के कारण होने वाली चगास बीमारी, दुनिया की सबसे उपेक्षित उष्णकटिबंधीय बीमारियों में से एक है, जिससे लगभग 13,000 वार्षिक मौतें होती हैं। संक्रमण अक्सर अतालता, दिल की विफलता और अचानक मृत्यु 1,2 सहित 30% रोगियों में कार्डियक पैथोलॉजी का उत्पादन करने वाले एक तीव्र से पुरानी अवस्था में आगे बढ़ता है। तीव्र चरण के दौरान परजीवी के खिलाफ मजबूत मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बावजूद, हृदय और कंकाल की मांसपेशियों जैसे ऊतकों में मेजबान के जीवन भर में परजीवी की कम संख्या बनी रहती है। अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की देरी से शुरुआत और परजीवी के गैर-प्रतिकृति रूपों की उपस्थिति सहित कई कारक, प्रतिरक्षा प्रणाली 3,4,5,6 द्वारा पूर्ण उन्मूलन से बचने के लिए टी क्रूज़ी की क्षमता में योगदान कर सकते हैं। इसके अलावा, परजीवी के गैर-प्रतिकृति निष्क्रिय रूप ट्रिपैनोसिडल दवाओं के लिए कम संवेदनशीलता प्रदर्शित करते हैं और कई मामलों में देखी गई उपचार विफलता के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं 7,8.
नई इमेजिंग तकनीकों का विकास संक्रमित ऊतकों में परजीवी के स्थानिक वितरण और उनके नियंत्रण में शामिल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ उनके संबंधों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने का अवसर प्रदान करता है। ये विशेषताएं प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा परजीवी नियंत्रण की प्रक्रियाओं की बेहतर समझ और पुराने ऊतकों में मौजूद दुर्लभ निष्क्रिय परजीवियों को ट्रैक करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
लाइट-शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) पतले-सेक्शनिंग के बिना बड़े ऊतकों या अंगों की 3 डी इमेजिंग के लिए सबसे व्यापक और निष्पक्ष तरीकों में से एक है। लाइट-शीट माइक्रोस्कोप केवल फोकल प्लेन में फ्लोरोफोरस को उत्तेजित करने, नमूनों की फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी को कम करने और अल्ट्रा-फास्ट कैमरों का उपयोग करके हजारों ऊतक परतों की छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए प्रकाश की एक पतली शीट का उपयोग करते हैं। ऊतकों में लेजर प्रकाश के उचित प्रवेश के लिए आवश्यक ऊतक पारदर्शिता का उच्च स्तर ऊतक डिलिपिडेशन और डिकोलराइजेशन के बाद अपवर्तक सूचकांक (आरआई) को समरूप करके प्राप्त किया जाता है, जो प्रकाश के बिखरने को कम करता है और उच्च गुणवत्ता वाली छवियोंको 9,10,11 प्रदान करता है।
पूरे चूहों की इमेजिंग के लिए ऊतक समाशोधन दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं 12,13,14, ऑर्गेनोइड 15,16,17, रिपोर्टर फ्लोरोसेंट मार्करों को व्यक्त करने वाले अंग 18,19,20,21,22,23, और हाल ही में मानव ऊतकों की सीमित संख्या24 . ऊतक समाशोधन के लिए वर्तमान तरीकों को तीन परिवारों में वर्गीकृत किया गया है: (1) कार्बनिक विलायक-आधारित विधियां जैसे डिस्को प्रोटोकॉल 25,26, (2) हाइड्रोगेल-आधारित विधियां, जैसे स्पष्टता 27, और जलीय विधियां, जैसे क्यूबिक (स्पष्ट, निर्बाध मस्तिष्क / . क्यूबिक प्रोटोकॉल अंग आकार और ऊतक अखंडता को बनाए रखते हैं, अंतर्जात रूप से व्यक्त रिपोर्टर प्रोटीन के प्रतिदीप्ति को संरक्षित करते हैं। इस तकनीक का सबसे हालिया अद्यतन, क्यूबिक-हिस्टोविजन (क्यूबिक-एचवी), फ्लोरोसेंटली-टैग किए गए एंटीबॉडी और डीएनए लेबलिंग28 का उपयोग करके एपिटोप्स का पता लगाने की भी अनुमति देता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल में, स्पष्ट बरकरार माउस ऊतकों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त टी क्रूजी का पता लगाने के लिए क्यूबिक पाइपलाइन का उपयोग किया गया था। ऑप्टिकली पारदर्शी ऊतकों को एलएसएफएम इमेज किया गया था, 3 डी का पुनर्निर्माण किया गया था, और टी क्रूज़ी संक्रमित कोशिकाओं, निष्क्रिय अमास्टिगोट्स और टी कोशिकाओं की सटीक कुल संख्या प्रति अंग स्वचालित रूप से मात्रा निर्धारित की गई थी। इसके अलावा, एंटीबॉडी और परमाणु दाग के साथ साफ अंगों की समान लेबलिंग प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक अपनाया गया था। ये दृष्टिकोण संक्रमित मेजबानों में टी क्रूज़ी के विस्तार और नियंत्रण को समझने के लिए आवश्यक हैं और चगास रोग के लिए कीमो- और इम्यूनो-थेरेप्यूटिक्स के पूरी तरह से मूल्यांकन के लिए उपयोगी हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
परजीवी के व्यापक, पूरे अंग इमेजिंग की अनुपस्थिति और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मेजबान-परजीवी इंटरैक्शन की जटिलता की समझ को सीमित करती है और चगास रोग के लिए उपचार के मूल्यांकन में बाधा डालती है। वर्तमान अ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ऊतक-समाशोधन और इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल के बारे में उनकी मूल्यवान सहायता और सिफारिशों के लिए डॉ एत्सुओ सुसाकी को धन्यवाद देते हैं। इसके अलावा, हम एलएसएफएम और कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करके तकनीकी सहायता के लिए सीटीईजीडी बायोमेडिकल माइक्रोस्कोपी कोर से एम कंडासामी के आभारी हैं। हम इस अध्ययन के दौरान उपयोगी सुझावों के लिए टारलटन रिसर्च ग्रुप के सभी सदस्यों को भी धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleton, R. L. CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection. Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).
- Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection. Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).
- Basso, B. Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).
- Martin, D. L., et al. CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLOS Pathogens. 2 (8), 77 (2006).
- Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure. Elife. 7, 34039 (2018).
- Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters. Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), 199369 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17, 9807 (2021).
- Pan, C., et al. Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body. Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11, 1982 (2020).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Bustamante, J. M., et al. A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease. Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).
- Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging. Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).
- Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Frontiers in Immunology. 11, 599495 (2020).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).
- Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues. Cell Reports. 33, 108349 (2020).
