Imaging 3D quantitativo di cellule infette da Trypanosoma cruzi, amastigoti dormienti e cellule T in organi chiarificati intatti
Summary
Il presente protocollo descrive la microscopia fluorescente a foglio luminoso e metodi automatizzati assistiti da software per visualizzare e quantificare con precisione i parassiti proliferanti e dormienti del Trypanosoma cruzi e le cellule T in organi e tessuti intatti e cancellati. Queste tecniche forniscono un modo affidabile per valutare i risultati del trattamento e offrono nuove informazioni sulle interazioni parassita-ospite.
Abstract
La malattia di Chagas è una patologia trascurata che colpisce milioni di persone in tutto il mondo, principalmente in America Latina. L’agente della malattia di Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), è un parassita intracellulare obbligato con una biologia diversificata che infetta diverse specie di mammiferi, compresi gli esseri umani, causando patologie cardiache e digestive. Il rilevamento affidabile delle infezioni in vivo da T. cruzi è stato a lungo necessario per comprendere la complessa biologia della malattia di Chagas e valutare accuratamente l’esito dei regimi di trattamento. L’attuale protocollo dimostra una pipeline integrata per la quantificazione automatizzata delle cellule infette da T. cruzi in organi ricostruiti in 3D e cancellati. La microscopia fluorescente a foglio luminoso consente di visualizzare e quantificare con precisione i parassiti T. cruzi attivamente proliferanti e dormienti e le cellule effettrici immunitarie in interi organi o tessuti. Inoltre, è stata adottata con successo la pipeline CUBIC-HistoVision per ottenere un’etichettatura uniforme degli organi eliminati con anticorpi e macchie nucleari. La pulizia dei tessuti accoppiata con l’immunocolorazione 3D fornisce un approccio imparziale per valutare in modo completo i protocolli di trattamento farmacologico, migliorare la comprensione dell’organizzazione cellulare dei tessuti infetti da T. cruzi e si prevede che farà avanzare le scoperte relative alle risposte immunitarie anti-T. cruzi, al danno tissutale e alla riparazione nella malattia di Chagas.
Introduction
La malattia di Chagas, causata dal parassita protozoo T. cruzi, è tra le malattie tropicali più trascurate al mondo, causando circa 13.000 morti all’anno. L’infezione spesso progredisce da uno stadio acuto a uno cronico producendo patologia cardiaca nel 30% dei pazienti, tra cui aritmie, insufficienza cardiaca e morte improvvisa 1,2. Nonostante la forte risposta immunitaria dell’ospite suscitata contro il parassita durante la fase acuta, un basso numero di parassiti persiste cronicamente per tutta la vita dell’ospite in tessuti come il cuore e il muscolo scheletrico. Diversi fattori, tra cui l’insorgenza ritardata delle risposte immunitarie adattative e la presenza di forme non replicanti del parassita, possono contribuire alla capacità di T. cruzi di evitare una completa eliminazione da parte del sistema immunitario 3,4,5,6. Inoltre, le forme dormienti non replicanti del parassita mostrano una bassa suscettibilità ai farmaci tripanocidi e possono in parte essere responsabili del fallimento del trattamento osservato in molti casi 7,8.
Lo sviluppo di nuove tecniche di imaging offre l’opportunità di ottenere informazioni sulla distribuzione spaziale dei parassiti nei tessuti infetti e sulla loro relazione con le cellule immunitarie coinvolte nel loro controllo. Queste caratteristiche sono cruciali per una migliore comprensione dei processi di controllo dei parassiti da parte del sistema immunitario e per tracciare i rari parassiti dormienti presenti nei tessuti cronici.
La microscopia a fluorescenza a foglio luminoso (LSFM) è uno dei metodi più completi e imparziali per l’imaging 3D di tessuti o organi di grandi dimensioni senza sezionamento sottile. I microscopi a foglio di luce utilizzano un sottile foglio di luce per eccitare solo i fluorofori nel piano focale, ridurre il fotosbiancamento e la fototossicità dei campioni e registrare immagini di migliaia di strati di tessuto utilizzando telecamere ultraveloci. L’elevato livello di trasparenza tissutale necessario per la corretta penetrazione della luce laser nei tessuti si ottiene omogeneizzando l’indice di rifrazione (RI) dopo la delipidazione e la decolorazione dei tessuti, che riduce la dispersione della luce e rende immagini di alta qualità 9,10,11.
Sono stati sviluppati approcci di pulizia dei tessuti per l’imaging di topi interi 12,13,14, organoidi 15,16,17, organi che esprimono marcatori fluorescenti reporter 18,19,20,21,22,23 e recentemente un numero limitato di tessuti umani 24 . Gli attuali metodi per la pulizia dei tessuti sono classificati in tre famiglie: (1) metodi a base di solventi organici come i protocolli DISCO 25,26, (2) metodi a base di idrogel, come CLARITY27, e metodi acquosi, come CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . I protocolli CUBIC mantengono la forma degli organi e l’integrità dei tessuti, preservando la fluorescenza delle proteine reporter espresse endogenamente. L’aggiornamento più recente di questa tecnica, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), consente anche la rilevazione di epitopi utilizzando anticorpi marcati con fluorescenza e marcatura del DNA28.
Nel presente protocollo, è stata utilizzata la pipeline CUBIC per rilevare T. cruzi che esprimono proteine fluorescenti in tessuti murini chiariti intatti. I tessuti otticamente trasparenti sono stati ripresi con LSFM, ricostruiti in 3D e il numero totale preciso di cellule infette da T. cruzi , amastigoti dormienti e cellule T per organo è stato quantificato automaticamente. Inoltre, questo protocollo è stato adottato con successo per ottenere un’etichettatura uniforme degli organi eliminati con anticorpi e macchie nucleari. Questi approcci sono essenziali per comprendere l’espansione e il controllo di T. cruzi negli ospiti infetti e sono utili per valutare pienamente la chemioterapia e l’immunoterapia per la malattia di Chagas.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’assenza di un’ampia imaging dell’intero organo dei parassiti e della risposta immunitaria limita la comprensione della complessità delle interazioni ospite-parassita e impedisce la valutazione delle terapie per la malattia di Chagas. Il presente studio ha adottato la pipeline CUBIC per chiarire e colorare organi e tessuti intatti di topi infetti da T. cruzi.
In questo studio sono stati testati più protocolli di pulizia dei tessuti (PACT32, ECi 33, FLASH<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Etsuo Susaki per il loro prezioso aiuto e le raccomandazioni riguardanti i protocolli di pulizia dei tessuti e immunocolorazione. Inoltre, siamo grati a M. Kandasamy del CTEGD Biomedical Microscopy Core per il supporto tecnico utilizzando LSFM e imaging confocale. Ringraziamo anche tutti i membri del Tarleton Research Group per gli utili suggerimenti durante questo studio.
Materials
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
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