Imágenes cuantitativas en 3D de células infectadas por Trypanosoma cruzi, amastigotes latentes y células T en órganos aclarados intactos
Summary
El presente protocolo describe la microscopía fluorescente de lámina de luz y los métodos automatizados asistidos por software para visualizar y cuantificar con precisión los parásitos Trypanosoma cruzi proliferantes y latentes y las células T en órganos y tejidos intactos y despejados. Estas técnicas proporcionan una forma confiable de evaluar los resultados del tratamiento y ofrecen nuevos conocimientos sobre las interacciones parásito-huésped.
Abstract
La enfermedad de Chagas es una patología desatendida que afecta a millones de personas en todo el mundo, principalmente en América Latina. El agente de la enfermedad de Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), es un parásito intracelular obligado con una biología diversa que infecta a varias especies de mamíferos, incluidos los humanos, causando patologías cardíacas y digestivas. La detección confiable de infecciones in vivo por T. cruzi ha sido necesaria durante mucho tiempo para comprender la compleja biología de la enfermedad de Chagas y evaluar con precisión el resultado de los regímenes de tratamiento. El protocolo actual demuestra una tubería integrada para la cuantificación automatizada de células infectadas por T. cruzi en órganos reconstruidos y despejados en 3D. La microscopía fluorescente de lámina de luz permite visualizar y cuantificar con precisión los parásitos T. cruzi que proliferan activamente y están latentes y las células efectoras inmunes en órganos o tejidos completos. Además, se adoptó con éxito la tubería CUBIC-HistoVision para obtener un etiquetado uniforme de los órganos despejados con anticuerpos y tinciones nucleares. La limpieza de tejidos junto con la inmunotinción 3D proporciona un enfoque imparcial para evaluar exhaustivamente los protocolos de tratamiento farmacológico, mejorar la comprensión de la organización celular de los tejidos infectados por T. cruzi y se espera que avance en los descubrimientos relacionados con las respuestas inmunes anti-T. cruzi, el daño tisular y la reparación en la enfermedad de Chagas.
Introduction
La enfermedad de Chagas, causada por el parásito protozoario T. cruzi, es una de las enfermedades tropicales más desatendidas del mundo, causando aproximadamente 13.000 muertes anuales. La infección a menudo progresa de una etapa aguda a una crónica produciendo patología cardíaca en el 30% de los pacientes, incluyendo arritmias, insuficiencia cardíaca y muerte súbita 1,2. A pesar de la fuerte respuesta inmune del huésped provocada contra el parásito durante la fase aguda, un bajo número de parásitos persiste crónicamente durante toda la vida del huésped en tejidos como el corazón y el músculo esquelético. Varios factores, incluyendo el inicio tardío de las respuestas inmunes adaptativas y la presencia de formas no replicantes del parásito, pueden contribuir a la capacidad de T. cruzi para evitar una eliminación completa por el sistema inmune 3,4,5,6. Además, las formas latentes no replicantes del parásito muestran una baja susceptibilidad a los fármacos tripanocidas y pueden ser en parte responsables del fracaso del tratamiento observado en muchos casos 7,8.
El desarrollo de nuevas técnicas de imagen brinda la oportunidad de obtener información sobre la distribución espacial de los parásitos en los tejidos infectados y su relación con las células inmunes involucradas en su control. Estas características son cruciales para una mejor comprensión de los procesos de control de parásitos por parte del sistema inmune y el seguimiento de los raros parásitos latentes presentes en los tejidos crónicos.
La microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM) es uno de los métodos más completos e imparciales para obtener imágenes 3D de tejidos u órganos grandes sin sección delgada. Los microscopios de lámina de luz utilizan una fina lámina de luz para excitar solo los fluoróforos en el plano focal, reducir el fotoblanqueo y la fototoxicidad de las muestras, y grabar imágenes de miles de capas de tejido utilizando cámaras ultrarrápidas. El alto nivel de transparencia tisular necesario para la correcta penetración de la luz láser en los tejidos se obtiene homogeneizando el índice de refracción (IR) después de la deslipidación y decoloración tisular, lo que reduce la dispersión de la luz y produce imágenes de alta calidad 9,10,11.
Se han desarrollado enfoques de limpieza de tejidos para la obtención de imágenes de ratones enteros 12,13,14, organoides 15,16,17, órganos que expresan marcadores fluorescentes reporteros 18,19,20,21,22,23, y recientemente un número limitado de tejidos humanos 24 . Los métodos actuales para la limpieza de tejidos se clasifican en tres familias: (1) métodos basados en solventes orgánicos como los protocolos DISCO 25,26, (2) métodos basados en hidrogel, como CLARITY27, y métodos acuosos, como CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . Los protocolos CUBIC mantienen la forma del órgano y la integridad del tejido, preservando la fluorescencia de las proteínas reporteras expresadas endógenamente. La actualización más reciente de esta técnica, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), también permite la detección de epítopos utilizando anticuerpos marcados con fluorescencia y marcado de ADN28.
En el presente protocolo, se utilizó la tubería CUBIC para detectar T. cruzi expresando proteínas fluorescentes en tejidos de ratón intactos clarificados. Se obtuvieron imágenes de tejidos ópticamente transparentes, se reconstruyeron en 3D y se cuantificó automáticamente el número total preciso de células infectadas por T. cruzi , amastigotes latentes y células T por órgano. Además, este protocolo se adoptó con éxito para obtener un etiquetado uniforme de los órganos despejados con anticuerpos y tinciones nucleares. Estos enfoques son esenciales para comprender la expansión y el control de T. cruzi en huéspedes infectados y son útiles para evaluar completamente la quimioterapia e inmunoterapéutica para la enfermedad de Chagas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ausencia de imágenes extensas de los parásitos y la respuesta inmune en todo el órgano limita la comprensión de la complejidad de las interacciones huésped-parásito e impide la evaluación de las terapias para la enfermedad de Chagas. El presente estudio adoptó la tubería CUBIC para aclarar y teñir órganos y tejidos intactos de ratones infectados con T. cruzi.
En este estudio se probaron múltiples protocolos de limpieza de tejidos (PACT32, ECi 33,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Etsuo Susaki por su valiosa ayuda y recomendaciones con respecto a los protocolos de limpieza de tejidos e inmunotinción. Además, agradecemos a M. Kandasamy del CTEGD Biomedical Microscopy Core por el apoyo técnico que utiliza LSFM e imágenes confocales. También agradecemos a todos los miembros del Grupo de Investigación Tarleton por sus útiles sugerencias a lo largo de este estudio.
Materials
| 1-methylimidazole | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine | TCI | D1876 | |
| 6-wells cell culture plates | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| anti-α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #007914 | Common Name: Ai14 , Ai14D or Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodide | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse | The Jackson Laboratory | Strain #032080 | Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Cleaning wipes Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanoacrylate-based gel superglue | Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium | Biotium | #60017 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Centrifuge tubes 15 mL | Corning | CLS430791 | |
| Falcon Centrifuge tubes 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920.BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 or #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenous injection needle 23-G | Sartori, Minisart Syringe filter | 16534 | |
| Kimwipes | lint free wipes | ||
| Light-sheet fluorescent microscope | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II imaging system | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Micropipette tips, 10 µL, 200 µL and 1,000 µL | Axygen | T-300, T-200-Y and T-1000-B | |
| Motorized pipet dispenser | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Mounting Solution | TCI | M3294 | |
| N-butyldiethanolamine | TCI | B0725 | |
| Nicotinamide | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamide | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serological pipettes | Costar Sterile | 4488 | |
| Shaking incubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Sodium azide (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
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