Summary
Dit protocol beschrijft de vorming van ondersteunde lipide bilayers en de toevoeging van cytoskeletale filamenten en motoreiwitten om de dynamiek van gereconstitueerde, membraangebonden cytoskeletale netwerken te bestuderen met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Abstract
Het oppervlak van een levende cel biedt een veelzijdig actief platform voor tal van cellulaire processen, die voortkomen uit het samenspel van het plasmamembraan met de onderliggende actine cortex. In de afgelopen decennia hebben gereconstitueerde, minimale systemen op basis van ondersteunde lipide bilayers in combinatie met actinefilamentnetwerken bewezen zeer instrumenteel te zijn bij het ontrafelen van basismechanismen en gevolgen van membraangebonden actinenetwerken, evenals bij het bestuderen van de functies van individuele membraan-geassocieerde eiwitten. Hier beschrijven we hoe dergelijke actieve composietsystemen in vitro kunnen worden gereconstitueerd die bestaan uit vloeistofondersteunde lipide bilayers gekoppeld via membraan-geassocieerde actine-bindende eiwitten aan dynamische actinefilamenten en myosinemotoren die gemakkelijk kunnen worden waargenomen via totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie. Een open-kamer ontwerp maakt het mogelijk om het systeem stap voor stap samen te stellen en systematisch vele parameters te regelen, zoals linker eiwitconcentratie, actineconcentratie, actinefilamentlengte, actine / myosineverhouding en ATP-niveaus. Ten slotte bespreken we hoe we de kwaliteit van het systeem kunnen controleren, hoe we veelvoorkomende problemen kunnen detecteren en oplossen en enkele beperkingen van dit systeem in vergelijking met het oppervlak van de levende cel.
Introduction
Het plasmamembraan van een levende dierlijke cel interageert voortdurend met het aangrenzende actinecytoskelet en samen vormen ze een actief composietmateriaal dat een veelheid aan cellulaire functies vervult 1,2. Om processen op deze lipidemembraan-actine-interface te bestuderen, is de reconstitutie van cytoskeletale netwerken bovenop ondersteunde lipide bilayers (SLBs) zeer nuttig gebleken. Deze minimale systeembenadering maakt de nauwkeurige controle van cytoskeletnetwerkcomponenten en lipidensamenstelling mogelijk. Vergeleken met de vrijstaande lipidemembranen van gigantische unilamellaire blaasjes, maakt de vlakke geometrie van SLB's efficiënt gebruik mogelijk van state-of-the-art microscopietechnieken zoals superresolutie 3,4, totale interne reflectiefluorescentie (TIRF)5,6,7 of interferometrische verstrooiing8 het bestuderen van de ruimtelijke organisatie en dynamiek van cytoskeletale netwerken. TIRF biedt het hoogste contrast voor fluorescerend gelabelde componenten, omdat het signaal van ongebonden gelabelde moleculen in de oplossing die bijdragen aan het achtergrondsignaal minimaal is.
Hier beschrijven we een basisprotocol voor de vorming van actomyosinenetwerken die zijn gekoppeld aan ondersteunde lipidebilagen, die op grote schaal in het veld worden gebruikt om de fysica van actieve, quasi-2D-netwerken 9,10,11 en hun effect op membraanorganisatie 3,5,12,13,14,15,16 te bestuderen (figuur 11 ). Deze aanpak is niet beperkt tot op actine gebaseerde netwerken, maar kan ook gemakkelijk worden aangepast om microtubuli, intermediaire filamenten of samengestelde netwerken van gemengde aard te verkennen en om een verscheidenheid aan interacties tussen lipidemembraaneiwitten en cytoskeletale componenten te bestuderen met behulp van oppervlaktegevoelige microscopiemethoden.
Om dit protocol gefocust te houden, hebben we een gedetailleerde beschrijving van de zuivering en etikettering van actine- en myosine-eiwitten uitgesloten of details over hoe de contractiliteit en organisatie van actomyosinenetwerken kunnen worden afgestemd en gecontroleerd. Men moet verwijzen naar andere protocollen die naast deze zijn gepubliceerd in de JoVE Methods Collection, In Vitro Reconstitution of Cytoskeleton Networks for Biomaterials, Biophysics and Active Matter Research17.
Figuur 1: Schema van het in vitro actine-membraan actieve composietsysteem. Gemaakt met Biorender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
1. Reagentia en apparatuur
- Bereid verse buffers zoals vermeld in tabel 1. Gebruik ultrapuur, gedeïoniseerd water met een weerstand van 18,2 MΩ·cm bij 25 °C. Steriliseer alle buffers door ze onder vacuüm door filters van 0,22 μm te laten lopen. Ontgas de buffers die worden gebruikt voor kolomchromatografie.
- Zuiver skeletspieractine zoals eerder beschreven18,19. Voeg 20% glycerol toe aan de uiteindelijke gezuiverde G-actineoplossing en maak aliquots van 500 μL (voor etikettering of bulkexperimenten) en 10 μL (voor individuele experimenten) volume. Flash bevriest de aliquots door de buisjes gedurende 30 s in vloeibare stikstof te dopen en ze vervolgens gedurende maximaal 18 maanden bij −80 °C op te slaan.
OPMERKING: Als alternatief kan gezuiverde actine of acetonpoeder commercieel worden gekocht. - Label gezuiverde skeletspieren G-actine met fluorescerende maleimidekleurstoffen zoals eerder beschreven5. Bepaal de concentratie en de mate van etikettering van het eiwit door spectrofotometrie met behulp van gecorrigeerde A290nm voor actine (εactine = 26.600 M-1 cm-1) en Aλmax van de kleurstof. Maak aliquots van 10 μL en flash bevriezen door de buizen gedurende 30 s in vloeibare stikstof te dopen en gedurende maximaal 18 maanden bij −80 °C te bewaren.
OPMERKING: Etikettering met lysine-conjugaterende NHS-esters zal niet-functionele actine creëren en moet worden vermeden. - Zuiver skeletspiermyosine II door het protocol20 te volgen. Voer SDS-PAGE uit met 10% polyacrylamidegel gevolgd door Coomassie-kleuring om het zuiverheidsniveau van het eiwit te bepalen21. Bewaar gezuiverde skeletspiermyosine-II bij −20 °C in vloeibare vorm in myosine II-buffer met 50% glycerol.
OPMERKING: De opgeslagen myosine II kan maximaal 2 jaar worden gebruikt. - Label gezuiverd myosine-II met fluorescerende maleimide kleurstoffen zoals eerder beschreven5. Vermijd het labelen van myosinemotoren met NHS-esters kleurstoffen. Bepaal de concentratie en mate van etikettering door spectrofotometrie met behulp van gecorrigeerde A280nm van myosine II en Aλmax van de kleurstof. Bewaar de gerecyclede myosine II (donker of geëtiketteerd) bij 4 °C en gebruik binnen 6 weken.
- Zuivering van capping protein
- Verkrijg murine capping eiwit door het volgen van een eerder protocol22. Voer SDS-PAGE uit met 10% polyacrylamidegel gevolgd door Coomassie-kleuring om het zuiverheidsniveau van het eiwit te bepalen. Meet de concentratie met A280nm capping protein (εCP = 99.530 M-1 cm-1).
- Voeg 20% glycerol toe aan de eiwitoplossing en maak 5 μL aliquots in 200 μL PCR-buisjes. Dompel de buizen in vloeibare stikstof en bewaar ze bij −80 °C gedurende maximaal 2 jaar.
OPMERKING: De aftopping van de eiwitactiviteit wordt gecontroleerd door vaste hoeveelheden fluorescerend G-actine te polymeriseren in aanwezigheid van verschillende hoeveelheden aftoppende eiwitten. De filamenten worden vervolgens onder een microscoop in beeld gebracht en hun lengteverdeling wordt gekwantificeerd. Hoe hoger de relatieve concentratie van capping protein, hoe korter de actinefilamentverdelingen. Zie Köster et al.5.
- Druk een fluorescerend membraan-actine linkereiwit uit, bijvoorbeeld, gebruik voor dit protocol 10xHis-YFP-EzrinABD (HYE), druk het uit in Bl21DE3* Escherichia Coli en zuiver zoals eerder beschreven23. Bepaal de concentratie van het eiwit door spectrofotometrie.
- Bewaar het eiwit in kleine aliquots in gelfiltratiechromatografiebuffer (of een andere geschikte buffer) met 20% glycerol bij −80 °C. Onder deze omstandigheden is het eiwit meer dan 2 jaar stabiel.
OPMERKING: De keuze van actine-membraan linker eiwit en fluorescerende marker hangt af van het type vraag dat men behandelt. Een breed scala aan lipide-linking strategieën zijn ontwikkeld in de afgelopen jaren, waaronder Histidine-tagged eiwitten24, biotine-streptavidin25 en single-stranded DNA26. - Bereiding van multi-lamellaire blaasjes (MLV's)
OPMERKING: De workflow van MLV's naar ondersteunde lipide bilayers is weergegeven in figuur 2.- Plaats 5-10 amberkleurige glazen injectieflacons in een glazen bekerglas van 200 ml. Vul het bekerglas met 2% reinigingsoplossing, net genoeg om de glazen injectieflacons onder te dompelen. Soniceer ze in een waterbad gedurende 30 minuten in volle pols en 65 °C.
- Haal de injectieflacons uit de oplossing en spoel ze grondig af met gedestilleerd water. Plaats de injectieflacons in een glazen bekerglas met 2 N NaOH en soniceer gedurende 20 minuten. Tijdens deze stap is geen verwarming nodig.
- Haal de injectieflacons uit de NaOH-oplossing en spoel grondig af met gedestilleerd water. Droog de injectieflacons in een heteluchtoven op 65 °C gedurende 2 uur of langer.
- Bewaar de gereinigde injectieflacons maximaal 6 weken in een schoon bekerglas afgesloten met transparante folie.
LET OP: Voer de volgende stappen uit in een chemische zuurkast. Behandel chloroform en de lipide-oplossingen met gasdichte Hamilton glazen spuiten om besmetting door plastic te voorkomen. - Spoel de Hamilton spuiten en een paar amberkleurige glazen injectieflacons meerdere keren af met pure chloroform. Neem het lipidenpoeder opgeslagen in glazen ampullen uit de -20 °C vriezer en voeg voldoende volumes chloroform toe om de lipidepoeders op te lossen tot concentraties van 10-25 mg / ml.
- Breng de oplossing over van de ampul naar een vers gereinigde injectieflacon met amberkleurig glas en etiketteer deze op de juiste manier. Voer deze stap uit op ijs om de verdamping van chloroform te verminderen.
- Maak een DOPC-stamoplossing met een concentratie van 10-25 mg /ml en DGS-NTA-Ni2+ met een concentratie van 1-10 mg / ml.
- Om een werkende lipidenmix te maken, neemt u een schone glazen injectieflacon en spoelt u deze 2x af met chloroform. Voeg 300 μL zuiver chloroform toe aan de injectieflacon om als basis te dienen voor een betere menging van de componenten. Dit heeft geen invloed op de uiteindelijke concentraties van de lipiden, omdat alle chloroform in de volgende stappen zal worden uitgedroogd.
- Voeg gemeten volumes stock lipide-oplossingen toe aan de injectieflacon om de gewenste werkende lipidenmengsels te maken. De beoogde lipidenconcentratie in lipiderehydratiebuffer is 4 mM. Droog het lipidenmengsel onder een langzame stroom N2-gas in de chemische kap bij kamertemperatuur. Deze stap kan tot 30 minuten duren voor elke injectieflacon.
- Nadat al het oplosmiddel is uitgedroogd, droogt u de lipidefilm gedurende >2 uur bij kamertemperatuur om eventuele sporen van chloroform te verwijderen. Resuspendeer de uitgedroogde lipidenmix in lipide rehydratatiebuffer voor een uiteindelijke lipideconcentratie van 4 mM.
- Incubeer gedurende 5-10 minuten om rehydratatie van de lipiden mogelijk te maken. Vortex de lipide-oplossing voor ongeveer 30 s om MLV's te vormen.
- Maak 0,5-1 ml aliquots van de MLV's in microcentrifugebuizen van 1,5 ml. Dompel de buisjes in vloeibare stikstof, sluit af met een transparante film en bewaar bij −20 °C (tot 6 weken).
OPMERKING: Lipide voorraadconcentraties worden gekozen om voldoende grote volumes mogelijk te maken die betrouwbaar pipetteren met behulp van de Hamilton-spuiten mogelijk maken. Als de volumes die nodig zijn om de voorraad te maken te groot zijn om het gedroogde lipidenpoeder op te lossen, maak dan meerdere verdunningen van de bouillon om een reproduceerbare menging van verschillende lipiden te garanderen.
- Bereiding van kleine unilamellaire blaasjes (SUV's)
- Haal een hoeveelheid MLV's uit de -20°C opslag en ontdooi deze bij kamertemperatuur. Flash bevries de blaasjes door de microcentrifugebuis gedurende 15-30 s in vloeibare stikstof te storten en onmiddellijk in een waterbad op 45 °C te zetten totdat de oplossing volledig is ontdooid (1-2 min). Herhaal de bovenstaande vries-dooicyclus 10x-15x totdat de oplossing er minder troebel uitziet.
OPMERKING: Stel de temperatuur van het waterbad hoger in dan de overgangstemperatuur van het lipidenmengsel dat wordt ontdooid om uniforme lipidenmenging mogelijk te maken. - Equilibrate een op spuit gebaseerde mini-extruder uitgerust met een 80 nm poriegrootte polycarbonaat filtermembraan met SUV-rehydratatiebuffer. Zorg ervoor dat er geen lekkage of bubbels in het systeem zitten. Terwijl de extrusiemethode monodisperse SUV's oplevert met minimale lipideschade, kunnen lipidenmengsels met negatieve lading aan het polycarbonaatmembraan kleven.
- Laat de ontdooide lipide-oplossing voorzichtig door de voorgebalanceerde extruder van de ene naar de andere kant en vervolgens terug. Herhaal de cyclus 5x-10x totdat de lipideoplossing zichtbaar helder wordt, wat de vorming van SUV's met een diameter van ~ 100 nm aangeeft.
- Centrifugeer de geëxtrudeerde suspensie (of tip-sonicate de oplossing; zie opmerking hieronder) bij 15.000 x g gedurende 60 minuten bij 4 °C om het lipideafval te pelleteren. Verzamel de bovenste 80% van de oplossing zonder de pellet te verstoren en zonder bubbels te creëren. Breng het supernatant met de SUV's over naar een verse microcentrifugebuis en bewaar het maximaal 6 dagen op ijs.
OPMERKING: Een alternatief voor centrifugatie is tip sonicatie uitgevoerd als volgt. Schakel een microtip sonicator in en stel de volgende instellingen in: Amplitude = 30% van het maximum, ON-tijd = 10 s, OFF-tijd = 60 s. Reinig de punt van de micro-sonicator met gedeïoniseerd water gevolgd door 2 N NaOH, chloroform en opnieuw gedeïoniseerd water. Dompel de sonicatortip in elk van deze oplossingen en soniceer gedurende 1-2 cycli met behulp van de bovenstaande instellingen. Dompel de schone punt in de bevroren ontdooide blaasjesoplossing en soniceer gedurende 3-6 cycli op ijs totdat de oplossing helder wordt. - Controleer na centrifugatie op tekenen van hoge lipideafbraak of een mislukte lipide-extrusie als de vorming van een dunne witachtige film en / of een duidelijk zichtbare pellet. Ga in deze gevallen niet verder en herhaal de SUV-voorbereidingsstappen opnieuw.
OPMERKING: De houdbaarheid van SUV's kan verschillen voor verschillende lipidenmengsels. SUV's gemaakt van DOPC: DGS-NTA-Ni2+ zijn stabiel voor maximaal 6 dagen voor de doeleinden van deze experimenten. Tips om veelvoorkomende problemen op te lossen zijn te vinden in tabel 2.
- Haal een hoeveelheid MLV's uit de -20°C opslag en ontdooi deze bij kamertemperatuur. Flash bevries de blaasjes door de microcentrifugebuis gedurende 15-30 s in vloeibare stikstof te storten en onmiddellijk in een waterbad op 45 °C te zetten totdat de oplossing volledig is ontdooid (1-2 min). Herhaal de bovenstaande vries-dooicyclus 10x-15x totdat de oplossing er minder troebel uitziet.
Figuur 2: Schematische weergave van de workflow van het bereiden van multilamellaire blaasjes en kleine unilamellaire blaasjes tot de vorming van ondersteunde lipide bilayers. Gemaakt met Biorender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Reconstitutie van membraangebonden actinenetwerken
- Voorbereiding van monsterkamers
- Neem 3-5 rechthoekige glazen coverslips en plaats ze in een Coplin-pot. Zet de badsonator aan en stel de temperatuur in op 65 °C. Vul de Coplin-pot met 2% reinigingsoplossing om de coverslips volledig onder te dompelen en plaats deze gedurende 30 minuten in de sonicator in de volledige pulsmodus.
- Gebruik een stompe PTFE-gecoate tang om de coverslips één voor één uit de pot te verwijderen. Spoel ze grondig af met gedestilleerd water en plaats ze in een andere Coplin-pot gevuld met 2 N NaOH.
- Soniceer de coverslips gedurende 20 minuten in de volledige pulsmodus. Verwijder de coverslips één voor één, spoel grondig af met gedestilleerd water en plaats in een andere Coplin-pot gevuld met gedestilleerd water.
OPMERKING: Optioneel, soniceer de coverslips in gedestilleerd water gedurende 20 minuten en spoel ze vervolgens opnieuw af met gedestilleerd water. - Neem vlak voordat u met het experiment begint de pot met de coverslips in een chemische kap met een N2-gastoevoer .
- Optimaliseer de luchtdruk van de N2-gasstroom met vallen en opstaan, zodat het net genoeg is om water van het afdekvlakoppervlak te verplaatsen zonder het te breken. Lijn de stroom van het N2-gas parallel aan het afdekvlak uit om de kans op het breken van de afdekplaat te verkleinen.
- Gebruik handschoenen en een tang om de coverslips één voor één uit de pot te verwijderen om ze onder de N2-stroom te drogen. Droog beide zijden van elke coverslip en plaats ze op een schoon plastic rooster met een deksel. Plaats de doos met de afdekplaten in een exsiccator om contact met stofdeeltjes in de lucht te voorkomen.
OPMERKING: De N2-gedroogde coverslips kunnen worden bewaard in een exsiccator waar ze tot 2 dagen hydrofiel kunnen blijven. Deze strategie kan nuttig zijn wanneer er veel dubbellagen nodig zijn voor het experiment of als het experiment langer duurt dan 8 uur. - Neem geautoclaveerde PCR-buizen en knip hun deksels en onderste conische helften uit met een scherp chirurgisch mes. Neem de cilindrische halfgesneden buizen één voor één, breng UV-uithardende lijm aan op de gladde rand van elke gesneden buis en plaats deze omgekeerd op een vers gereinigde coverslip, zodat de rand plat op de coverslip zit.
- Beweeg de cilinder niet zijdelings zodra deze op de afdekplaat is geplaatst om ervoor te zorgen dat de lijm niet naar de centrale ruimte van de kamer morst. Rechthoekige coverslips bieden comfortabel plaats aan maximaal drie reactiekamers en de ronde kamers bieden plaats aan slechts één in het midden (figuur 1).
- Plaats de kamerdragende afdekplaten in een UV-ozonreiniger met een O2-voeding en vacuüm (of gebruik een UV-verlichting). Zet het UV-licht aan en brand gedurende 3-5 minuten om de lijm te laten polymeriseren. Voer langere verlichting uit (10-15 min) om de hydrofielheid van het afdekglas en dus de kwaliteit van de lipide bilayer te verbeteren.
- Bewaar de droge UV-verlichte monsterkamers tot 8 uur in kleine plastic dozen (zoals lege rechthoekige afdekdozen) gewikkeld in transparante film om contact met stofdeeltjes in de lucht te verminderen.
OPMERKING: Een gestage stroom van O2 in aanwezigheid van UV-licht vormt ozon- en zuurstofradicalen die organische onzuiverheden van het oppervlak van de coverslip kunnen verwijderen. Een vacuüm voorkomt het lekken van giftige ozon die tijdens het proces wordt gevormd. - Verwijder de coverslips en test de kamers op lekkage door ze te vullen met gedestilleerd water. Elke kamer kan tot ~150 μL monster bevatten. Gooi de lekkende kamers weg.
OPMERKING: Een andere geweldige en veilige reinigingsoptie is de plasmareiniger. De tijd- en vermogensinstellingen zijn afhankelijk van het model, maar zorg ervoor dat u de glasglaasjes niet overhandelt met plasma, omdat dit zal resulteren in een vermindering van de lipidemobiliteit. De oppervlaktebehandeling kan de mobiliteit van lipiden beïnvloeden27, zoals is waargenomen bij langdurige behandeling met de reinigingsoplossing (>45 min) of NaOH (>30 min).
- Bereiding van ondersteunde lipide bilayers
- Was elke kamer met SLB-formatiebuffer (of 1x PBS) om eventuele oppervlakteverontreinigingen te verwijderen, waardoor aan het einde 100 μL buffer overblijft. Markeer het niveau van de buffer op 100 μL met een permanente marker om veranderingen in het volume reproduceerbaar te volgen.
- Voeg 2 μL van 0,1 M CaCl2 toe aan de kamer. Dit verbetert de adsorptie van de blaasjes aan het glasoppervlak, waardoor de bilayer-vorming in de volgende stap wordt verbeterd. Voeg 8 μL van de SUV-oplossing (vanaf stap 1.10.) toe aan elke kamer en incubeer gedurende 15 minuten bij 25 °C.
OPMERKING: Het volume van de toe te voegen SUV-mix kan worden geschat door het totale aantal lipiden (met een gemiddeld oppervlak van 0,72 nm2) te berekenen die nodig zijn om het blootgestelde hydrofiele gebied van de put volledig te bedekken met twee lipidelagen. - Was de ongebonden blaasjes af met actine motiliteitsbuffer (1x KMEH). Verwijder eerst 50 μL van de SLB-vormingsbuffer, waardoor er slechts 50 μL in de monsterkamer overblijft. Voeg ten tweede 100 μL 1x KMEH toe aan de kamer. Meng voorzichtig en verwijder vervolgens 100 μL van de buffer zonder de bodem aan te raken.
OPMERKING: Het is belangrijk om voorzichtig te zijn tijdens het wassen. Zorg ervoor dat de pipetpunt de onderkant van de kamer niet raakt. Houd de pipet geneigd om de bufferstroom naar de wand van de kamer te leiden en niet direct naar de bilayer, omdat een directe stroom de bilayer kan verstoren. Zorg ervoor dat u tijdens het pipetteren geen luchtbellen introduceert, omdat lucht de lipide bilayer kan bereiken en defecten daarin kan veroorzaken. - Herhaal de wasbeurten 10x door 100 μL 1x KMEH toe te voegen en 100 μL te verwijderen.
- Voeg 10 μL 1 mg/ml β-caseïne toe aan de bilaag, meng voorzichtig en incubeer gedurende 5-10 minuten. β-caseïne blokkeert de gebieden op de deklip waar de bilaag zich niet heeft gevormd. Was β-caseïne 3x af met 1x KMEH zoals beschreven in stap 2.2.3. en breng het bufferniveau terug naar de 100 μL-markering.
- Toevoeging van membraan-actine linker
- Haal tijdens de incubatie van β-caseïne (stap 2.2.5.) een aliquot membraan-actine linkereiwit uit −80 °C, ontdooi het snel bij 37 °C en houd het vervolgens op ijs. Verdun de aliquot met eiwitverdunningsbuffer tot een concentratie van 1 μM.
- Voeg het linkereiwit toe in een gedefinieerde eindconcentratie (meestal 5-20 nM) en meng voorzichtig. Om een snelle equilibratie van het eiwit in de kamer te garanderen, voegt u volumes toe die groter zijn dan 20 μL door het linkereiwit vooraf te mengen met 1x KMEH.
- Incubeer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur. Was 3x met 1x KMEH buffer om het ongebonden HSE eiwit te verwijderen (zoals in stap 2.2.3.). Breng het bufferniveau in elke kamer terug naar de 100 μL-markering. Het monster is nu klaar voor beeldvorming.
- Kwaliteitsbeoordeling van de lipide bilayer
OPMERKING: Dit is een optionele stap die niet elke keer hoeft te worden uitgevoerd. We raden aan deze beoordeling uit te voeren telkens wanneer verse SUV's worden gemaakt van bevroren MLV-voorraden.- Schakel de microscoop, de excitatielasers en de detectiecamera's in. Zorg ervoor dat de laser is uitgelijnd, het doel is schoongemaakt en de software klaar is om afbeeldingen te verkrijgen.
- Doe olie op het 100x-objectief, monteer het monster op het microscoopstadium en richt het doel op de bilayer. Zorg ervoor dat de laserpositie zodanig is dat deze een totale interne reflectie op het monster ondergaat. Gebruik een 488 nm excitatielaser om de fluorescentie-intensiteitsverdeling van de bilayer-gebonden 10xHis-YFP-EzrinABD te controleren.
OPMERKING: Bilayers van goede kwaliteit vertonen een grootschalige, uniforme verdeling van fluorescentie-intensiteit. Slechte bilayers vertonen intense en fragmentarische fluorescerende vlekken. - Om de integriteit van de bilayer te bepalen, voert u een FRAP-test uit.
- Selecteer een interessegebied op de bilayer en neem enkele beelden van het gezichtsveld op met behulp van beeldomstandigheden die een signaal-ruisverhouding van 5:1 of hoger bieden. Pauzeer de opname en sluit het veldmembraan van de TIRF-microscoop om een geconcentreerde laserstraal op een klein cirkelvormig gebied van de bilayer te richten om de fluoroforen lokaal te bleken.
- Schakel de laser in op de maximale uitvoer om het kleine gebied gedurende 3-10 s te fotograferen en schakel vervolgens de laser uit. Heropen het veldmembraan tot de oorspronkelijke straal, pas de beeldconditie weer aan naar (pre-bleach) instellingen en ga onmiddellijk verder om het herstel van fluorescerend signaal in het gezichtsveld vast te leggen.
- Controleer of de bilayer vloeibaar is. Goede bilayers met normale laterale diffusie herstellen snel, terwijl slechte bilayers langzaam herstellen of helemaal niet herstellen (figuur 3). Als de bilayer niet herstelt, controleert u het gedeelte probleemoplossing en start u opnieuw op. Sla de afbeeldingen op als 16-bits TIFF-bestanden. Voor een kwantitatieve schatting van de diffusiecoëfficiënt, controleer stap 3. onder.
- Polymerisatie van fluorescerend actine
OPMERKING: Om tijd te besparen, begint u met het polymeriseren van actine tijdens de incubatietijd van het HSE-eiwit dat zich bindt aan de bilaag (stap 2.3.) of tijdens de kwaliteitsbeoordeling van de bilayer (stap 2.4.).- Meng ongelabelde en fluorescerend gelabelde G-actine in een molaire verhouding van 10:1 en vul deze aan met G-Buffer zodat de concentratie G-actine 20 μM is. De concentratie waarbij actine uiteindelijk wordt gepolymeriseerd, zal 1/4 van deze waarde zijn. Voeg 1/10 van 10x ME buffer toe aan de mix voor een 1x oplossing en incubeer gedurende 2 min. Deze stap vervangt de Ca2+ ionen gebonden aan G-actine door Mg2+ ionen. Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume in veelvouden van 10 μL is.
- Voeg als volgt de gewenste hoeveelheid capping-eiwit toe. Ontdooi een injectieflacon met afdekeiwitte bouillon snel bij 37 °C en houd deze vervolgens op ijs. Verdun met G-buffer zodanig dat de concentratie van capping protein nu tweemaal de gewenste eindconcentratie in de polymerisatiemix is. Voeg vanaf stap 2.5.1 een gelijk volume van de verdunde capping protein-oplossing toe aan het actinemengsel.
- Voeg ten slotte een gelijk volume verse 2x doelbuffer toe aan de reactiemix. Het uiteindelijke volume van de oplossing moet viermaal het volume van het actinemengsel aan het einde van stap 2.5.2 bedragen. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van KMEH 1x is, van ATP 1 mM, van BSA is 1 mg / ml en van G-actine is 5 μM.
Incubeer in het donker bij 25 °C gedurende 45-60 minuten om polymerisatie mogelijk te maken.
OPMERKING: Dit wordt de doelbufferstrategie genoemd, waarbij één volume Mg2+ G-actine (stap 2.5.1.) wordt gemengd met één volume capping protein mix (stap 2.5.2.) en twee volumes 2x doelbuffer (stap 2.5.3.). Dit maakt het gemakkelijker om de hoeveelheid actine op of af te schalen en de relatieve concentratie van capping-eiwit (of een andere actinemodulator; Figuur 4).
- Toevoeging van fluorescerende actinefilamenten
- Knip een paar 200 μL tips met een scherp mes of schaar om ze stomp te laten eindigen. Pipetteer voorzichtig het vereiste volume van 5 μM gepolymeriseerd actine (vanaf stap 2.5.3.) met een stompe pipetpunt (om afschuiving van actinefilamenten te voorkomen) en voeg deze toe aan een schone geautoclaveerde PCR-buis.
- Voeg 1x KMEH toe aan de buis om het volume >20 μL te maken en meng voorzichtig om scheren van F-actine te voorkomen. Verwijder uit de gemonteerde monsterkamer een gelijk volume van de buffer.
- Voeg de gepolymeriseerde actineoplossing toe aan de kamer en pipetteer voorzichtig 3x op en neer zonder de dubbellaag aan de onderkant aan te raken. Hierdoor kunnen actinefilamenten zich gelijkmatig verdelen over de dubbellaag. Monteer het monster op de TIRF-microscoop (zie stap 2.4.1 en stap 2.4.2.).
- Men kan het proces van F-actinebinding aan de bilayer vastleggen. Incubeer gedurende 20-30 min. Neem een paar beelden op uit verschillende gezichtsvelden nadat de toevoeging van F-actine een stabiele toestand heeft bereikt. Observeer verandering in de ruimtelijke organisatie van 10xHis-YFP-EzrinABD voor (homogeen) en na actine organisatie.
OPMERKING: HYE is gelijkmatig verdeeld over de lipide bilayer in afwezigheid van actine. Na toevoeging van actinefilamenten colocaliseert HYE met F-actine. De mate van colocalisatie hangt af van de actinebindende affiniteit van het linkereiwit; hoe sterker de affiniteit, hoe hoger de colocalisatie en hoe langzamer de laterale mobiliteit van het linkereiwit (figuur 5).
- Toevoeging van myosine II
- Na 30 minuten actine-incubatie monteert u het monster terug op de microscoop (als het niet was gemonteerd). Controleer het signaal in de linker eiwit- en F-actinekanalen. Pas indien nodig de beeldomstandigheden aan.
- Selecteer een goed gebied met een uniform linker eiwitsignaal en gelijkmatig verspreide actinefilamenten en geen artefacten voor een lange time-lapse-opname. Neem 10-15 frames op 0,1-0,2 Hz op voordat myosine wordt toegevoegd en pauzeer de opname. Pipetteer het vereiste volume gerecycled spiermyosine-II uit de voorraadflacon met een stompe pipetpunt (om het afschuiven van myosinefilamenten te voorkomen) en voeg toe aan een schone geautoclaveerde PCR-buis.
- Voeg onmiddellijk 1x KMEH toe aan de buis om het volume > 20 μL te maken en meng voorzichtig. Men kan ook ATP, ATP regenererende mix, fotostabilisatoren, enz. Toevoegen. tijdens deze stap. Verwijder voorzichtig een gelijk volume van de buffer uit de gemonteerde monsterkamer zonder deze te storen.
- Voeg de myosineoplossing voorzichtig toe aan de monsterkamer. Pipetteer niet op en neer, omdat dit de oppervlaktegebonden filamenten zal verstoren. Hervat onmiddellijk de time-lapse-opname en observeer het systeem terwijl het evolueert van de pre-myosinetoestand naar ATP-gevoede contractiele acto-myosinestromen en astervorming naar een ATP-uitgeputte vastgelopen toestand (zie representatieve resultaten).
- Maak achtergrondafbeeldingen voor alle kanalen met alleen een buffervoorbeeld. Sla alle afbeeldingen op als 16-bits .tiff bestanden. Zie tabel 2 voor tips om veelvoorkomende problemen op te lossen.
Figuur 3: Kwaliteitsbeoordeling van de bilayers met snelle FRAP-assay. Ondersteunde lipide bilayers (SLBs) bereid uit DOPC en Ni-NTA lipiden (98:2 mol%) zijn gecoat met HYE (10xHis-YFP-tagged membrane-actin linker). Nadat het ongebonden eiwit is weggespoeld, wordt de fluorescerende bilaag in beeld gebracht onder een TIRF-microscoop. Een klein gebied op de bilayer wordt gefotobleacheerd met een hoog laservermogen en het herstel van fluorescentie wordt geregistreerd. (A) Een goede bilayer herstelt altijd snel, met een verwachte diffusiecoëfficiënt van 1-1,5 μm2/s voor de lipidesamenstelling die in dit geval wordt gebruikt. (B) Slechte dubbellagen herstellen zeer langzaam of herstellen helemaal niet. (C) Representatieve afbeeldingen van slechte bilayers: (C-i) een bilayer met gaten, (C-ii) een bilayer met grote, immobiele lipide patches, en (C-iii) een bilayer met kleine, immobiele stippen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Schematische weergave van het polymeriseren van actine met behulp van de doelbuffermethode. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Ruimtelijke organisatie van HYE bij binding aan F-actine. TIRF-snapshots die de ruimtelijke organisatie van HYE laten zien voor en na de toevoeging van actinefilamenten (gelabeld met Atto-635 maleimide). De HYE-organisatie is homogeen vóór de toevoeging van F-actine en wordt gecolokaliseerd en gecoaleerd langs actinefilamenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Data-analyse
- Gebruik Fiji-software (https://imagej.net) en trek de achtergrond af van de linker-eiwitafbeeldingen (van stap 2.4.). Meet de gemiddelde intensiteitswaarden van de gebleekte plek en een referentiegebied.
- Normaliseer de tijdsporen van de gebleekte plek en het referentiegebied naar de intensiteit van hun respectieve pre-bleekintensiteitswaarden. Deel elk tijdstip in de genormaliseerde gebleekte regiowaarden door de respectieve tijdspunten in de genormaliseerde tijdstracering van het referentiegebied. Corrigeer het resulterende genormaliseerde tijdspoor voor achtergrond en voor eventuele systematische schommelingen in intensiteit tijdens acquisitie (globale fotobleaching, z-drift, enz.).
- Gebruik een aanpassingsvrije, handmatige methode28 om de diffusiecoëfficiënt van de dubbellaagse tethered eiwitten te schatten. In het kort kan de halftijdse van het herstelprofiel, τ1/2, worden berekend door te kijken naar het moment waarop het genormaliseerde herstelprofiel de helft van zijn steady state bereikt:
Hier is F0 de gemiddelde intensiteit in het gebleekte gebied in het eerste frame na fotobleaching, en F∞ is de langetermijn steady state waarde van herstel van de bilayer. - Schat de effectieve bleekstraal, re, een parameter die corrigeert voor diffusie tijdens fotobleaching, op basis van een lijnscan van het postbleekpuntprofiel29. De halve breedte op de helft van deze lijnscan die door het midden van de bleekplek gaat, r1/2, heeft betrekking op re als volgt:
De in stap 2.8.3 berekende τ 1/2, re berekend in stap 2.8.4. en de oorspronkelijk ingestelde bleekstraal, rn, worden gebruikt om de diffusiecoëfficiënt (D) te berekenen met behulp van de volgende formule:
- Gebruik een aanpassingsvrije, handmatige methode28 om de diffusiecoëfficiënt van de dubbellaagse tethered eiwitten te schatten. In het kort kan de halftijdse van het herstelprofiel, τ1/2, worden berekend door te kijken naar het moment waarop het genormaliseerde herstelprofiel de helft van zijn steady state bereikt:
- Beeldanalyse van actomyosine-asters
- Gebruik Fiji om de achtergrond af te trekken van alle opgenomen beelden in alle kanalen. Corrigeer de afbeeldingen voor niet-uniforme verlichting of interferentiepatronen met behulp van vlakke veldcorrectie.
OPMERKING: Men kan gekleurde plastic dia's gebruiken, die goede platte monsters zijn om dergelijke correcties uit te voeren. Voor de linker eiwit- en actinefilamenten op een vlakke bilayer kan men ook de gemiddelde projectie van meerdere pre-myosinebeelden gebruiken om kanaalspecifieke verlichtingscorrectiekaarten te maken.- Neem voor het HYE-kanaal, hier weergegeven, een gemiddelde intensiteitsprojectie van meerdere HYE-beelden (opgenomen uit verschillende regio's van de lipide bilayer vóór myosine-toevoeging). Pas een geschikt Gaussisch filter (σ = 50 pixels tot 80 pixels) toe op de gemiddelde projectie (van pre-myosineafbeeldingen of een standaard plat voorbeeld).
- Converteer de gefilterde afbeelding naar een 32-bits afbeelding. Deel alle pixelwaarden door het gemiddelde van de hele afbeelding. Dit geeft een genormaliseerde correctiekaart voor het HYE-kanaal. Verdeel alle afbeeldingen in het HYE-kanaal met deze kaart voor vlakke veldcorrectie. Maak correctiekaarten voor andere kanalen met dezelfde strategie.
- Correct voor fotobleaching met behulp van een exponentiële of eenvoudige verhoudingsmethode (afhankelijk van het intensiteitsvervalprofiel) in Fiji.
- Om te corrigeren voor een tijdelijke x-y-uitlijning (translatiebeweging), voegt u alle voor fotobleach gecorrigeerde kanalen samen in één Hyperstack. Gebruik de Hyperstack-Reg plugin in Fiji om een Rigid Body of Translation transformatie toe te passen.
- Splits ten slotte de uitgelijnde Hyperstack in afzonderlijke kanalen en sla ze afzonderlijk op als 16-bits TIFF-stacks voor verdere analyse.
- Gebruik Fiji om de achtergrond af te trekken van alle opgenomen beelden in alle kanalen. Corrigeer de afbeeldingen voor niet-uniforme verlichting of interferentiepatronen met behulp van vlakke veldcorrectie.
Representative Results
Voor representatie wordt hier een typisch postbleach profiel van de 1e afbeelding na fotobleaching (afbeelding bij t = 0 s in figuur 3A) en de pasvorm ervan voor de volgende functie28 (zie figuur 6A) getoond:
De waarde van re (23,94 μm) berekend door de fit op deze curve is zeer vergelijkbaar met de re berekend in stap 2.8.4. (23,24 μm). Hier is K een bleekdiepteparameter die direct kan worden geschat op basis van F0 (beschreven in stap 2.8.4.). Evenzo toont figuur 6B het herstelprofiel en de fit ervan voor de volgende functie28:
We vinden de passende waarde van de diffusiecoëfficiënt 1,34 μm2/s, een waarde die nauw overeenkomt met de waarde van 1,39 μm2/s die wordt berekend met de formule in stap 2.8.4. Hier staat MF voor de mobiele fractie van de lipide bilayer die de fractie van de gebleekte populatie vertegenwoordigt die herstelt. De mobiliteit van lipide-verankerde moleculen hangt natuurlijk af van de lipidesamenstelling en de fysieke toestand ervan (vloeistof- of gelfase). Voor onze experimenten met op DOPC gebaseerde lipidembranen moet de mobiliteit > 1 μm2 /s zijn en mag de mobiele fractie niet minder dan 0,9 zijn om een goede lipide-bilaag aan te geven. We raden het gebruik van de handmatige fittingvrije methode aan voor een snelle test van de kwaliteit en mobiliteit van de bilayer. De aanpassingsmethode kan nuttig zijn bij het automatiseren van de analyse voor veel FRAP-curven. Verder, als men een meer geavanceerd FRAP-experiment wil uitvoeren om diffusie in het systeem systematisch te karakteriseren, raden we de lezer aan deze recensie van Lorén et al.30 voor meer informatie over pasmodellen en mogelijke valkuilen in experimenteel ontwerp.
Figuur 6: Kwantificering van de diffusiecoëfficiënt van lipide bilayers. (A) Lijnprofiel van de eerste afbeelding na fotobleaching (t = 0 s in figuur 3A) en de fit met vergelijking 4 om de effectieve bleekstraal te berekenen. B) Het herstelprofiel van het gebleekt gebied en de aanpassing ervan aan vergelijking 5 om de diffusiecoëfficiënt en mobiele fractie te berekenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een typisch resultaat van de hierboven beschreven experimenten die de dynamische assemblage en organisatie van een acto-myosinenetwerk laten zien, gekoppeld aan een ondersteunde lipide bilayer afgebeeld door TIRF-microscopie, wordt weergegeven in figuur 7 en aanvullende video S1.
Figuur 7 toont een beeldmontage van het linkereiwit, F-actine en myosine-II.
Figuur 7: Contractiele actomyosinestromen stimuleren lokale clustering van het membraan-actine linker eiwit HYE. TIRF-snapshots van HYE (YFP-tagged), actinefilamenten (gelabeld met Atto-635 maleimide) en myosine II-filamenten (gelabeld met Atto-565 maleimide) na toevoeging van myosine II aan een SLB die HYE en F-actine bevat. Tijd wordt bovenaan aangegeven: 0 min is onmiddellijk voordat fluorescerende myofilamenten in het TIRF-veld begonnen te verschijnen. HYE en F-actine zijn homogeen verdeeld over de lipide bilaag voorafgaand aan myosinetoevoeging (0 min). Myosine-activiteit induceert contractiele actomyosinestromen, die in de steady state (15 min) in asterachtige structuren terechtkomen, waardoor lokale clustering van de gekoppelde membraancomponent (HYE) wordt aangedreven. De onderste rij is een samenvoeging van actine (geel) en myosine II (magenta) afbeeldingen die de organisatie van actine en myosine op verschillende tijdstippen laten zien. De beelden die werden gebruikt bij het maken van deze montages werden in Fiji gecorrigeerd voor achtergrondsignaal, niet-uniforme intensiteitspatronen en translationele beweging. Schaalbalk = 10 μm. Zie Aanvullende video S1 voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Buffernaam | Compositie | |
| Lipide rehydratatiebuffer | 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5% sucrose, pH 7,5 | |
| SLB-formatiebuffer | 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 5-6 | |
| SLB Opslagbuffer | 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,2 | |
| Eiwitverdunningsbuffer | 20 mM HEPES, 100 mM KCl, 1mM TCEP of DTT, pH 7,2 | |
| 1X ME of Actin ionenuitwisselingsbuffer | 50 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7,2 (bewaren bij 4°C) | |
| 1X KMEH of Actin polymerisatie buffer | 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM HEPES, pH 7,2 | |
| 100 mM ATP voorraad | 100 mM ATP dinatriumzout, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM EGTA, pH 7,5 (bewaren bij -20°C) | |
| 2x Doelbuffer | 2x KMEH, 2 mg/ml BSA, 2mM ATP, 5mM TCEP (bewaard bij 4°C) | |
| G-buffer | 2 mM Tris, 0,1 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 0,5 mM TCEP, 0,04 % NaN3, pH 8 (bewaren bij 4°C) | |
| Myosine II buffer | 500 mM KCl, 1 mM EDTA, 10-20 mM Hepes, pH 7,0 | |
| Gelfiltratie chromatografie buffer | 50 mM Tris-HCl, 150-300 mM NaCl, 5 mM TCEP, 0,1% Tween-20, pH 7,5 | |
| Afdekken van eiwit Opslagbuffer | 10 mM Tris · Cl, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5, 20% glycerol | |
Tabel 1: Lijst van buffersamenstellingen die in dit protocol worden gebruikt.
| Veelvoorkomende problemen en hun probleemoplossing | Probleem | Oorzaak | Mogelijke oplossingen | ||||||
| 1 | Lipide bilayer vertoont geen diffusie | De meest waarschijnlijke oorzaak voor dit probleem is vuil afdekglas dat kan optreden wanneer de reinigingsoplossing verouderd is of de verwarming niet heeft plaatsgevonden tijdens het ultrasoonapparaat in het bad. Deze dubbellagen hebben een 'vesiculaire' uitstraling doordat de gebarsten blaasjes aan het dekglas kleven maar niet met elkaar versmelten. Het gebruik van MLV's ouder dan 6 weken of SUV's ouder dan 6 dagen, of het toevoegen van lage hoeveelheden SUV's kan ook leiden tot vesiculaire bilayervorming. | Gebruik een verse reinigingsoplossing. Zorg ervoor dat de kachel is ingeschakeld en dat de temperatuur tussen de 45-65 °C ligt. Gebruik verse lipidenmixen. (Het gebruik van een fluorescerende lipidensonde versus een fluorescerende eiwitsonde kan zich soms anders manifesteren. Bijvoorbeeld, als de bilayer subdiffractiedefecten heeft en de oppervlaktepassiveringsstap wordt overgeslagen (of niet werkt), zal de lipidensonde een uniforme intensiteitsverdeling vertonen, maar de fluorescerende eiwitsonde kan heldere fluorescerende vlekken vertonen. ) | ||||||
| 2 | Lipide bilayer heeft heldere vlekken | Lange incubatie van SUV's voor bilayer-vorming kan een lipide bilayer creëren die over het algemeen diffuus is, maar met af en toe heldere vlekken. Deze patches kunnen meerlaagse dubbellagen zijn die grote hoeveelheden fluorescerende sonde kunnen aantrekken. | 15-20 minuten incubatie met SUV's is voldoende. Zorg ervoor dat de sonde niet aggregeert: een snelle harde draai van het linkereiwit (300 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C) kan de aggregaten verwijderen | ||||||
| 3 | Lipide bilayer heeft donkere gaten | Dit gebeurt wanneer de bilayer wordt gemaakt van oude SUV's en gedurende langere uren in beeld wordt gebracht (> 4 uur na de vorming), of de pH van de oplossing drastisch verandert als gevolg van langdurige beeldvorming (bijvoorbeeld in de hoge ATP-toestand en in de aanwezigheid van bepaalde zuurstofvangers), of wanneer het oppervlak overgepassiveerd is met bèta-caseïne (te veel bèta-caseïne toevoegen gedurende meer dan 10-15 minuten en of niet uitwassen). | Gebruik verse lipiden. Verminder de beeldframesnelheid of de effectieve laserverlichtingstijd. Gebruik buffers met een hogere buffercapaciteit. | ||||||
| 4 | Lipide bilayer vertoont langzame diffusie | Lipide bilayers met een hoog percentage cholesterol, lange verzadigde lipiden of geladen lipiden diffunderen langzamer. | Bereid in dergelijke gevallen uw monster op een hoge temperatuur. Men kan ook een eenvoudige, geteste lipidesamenstelling gebruiken als controle, samen met complexe en niet-geteste lipidesamenstellingen. Zorg ervoor dat het glas schoon is. | ||||||
| 5 | Actine polymeriseert niet | Doelbuffer is oud, G-actinevoorraad is te oud, oud en nieuw G-actine werden gecopolymeriseerd. | Zorg ervoor dat de Ca2+ vóór polymerisatie wordt vervangen door Mg2+ (met behulp van ME-buffer). Gebruik verse ATP-Mg2+ voorraad. Gebruik vers gerecyclede G-actine. Zorg ervoor dat de concentratie F-actine (in termen van G-actine) toegevoegd aan de bilayer hoger is dan 0,2 μM. Gebruik voor lagere concentraties phalloidine gestabiliseerd F-actine. | ||||||
| 6 | Actine bindt niet aan de bilayer | Membraan-actine linker wordt niet toegevoegd of toegevoegd in zeer lage concentratie - dit kan worden afgeleid uit de fluorescentie van het linkereiwit. Als de fluorescentie behoorlijk is, heeft de membraan-actine linker actine-bindende capaciteit verloren. Ook als het linkereiwit niet-specifiek gebonden is aan het glasoppervlak (wanneer de dubbellaag slecht is), kan het geen actinefilamenten rekruteren. | Zorg ervoor dat de bilayer diffundeert. Gebruik verse linker eiwitten | ||||||
| 7 | Fluorescerend F-actinesignaal is zwak | De verhouding tussen gelabeld en donker actine is te laag. Ofwel de gelabelde actine of ongelabelde actine is te oud en ze copolymeriseren niet met elkaar. | Recycle actine opnieuw en probeer de ploymerisatie opnieuw met vers gerecyclede actine. Fotoschade kan F-actine vernietigen of depolymeriseren; gebruik indien mogelijk rode of verrode kleurstoffen voor actine (en myosine). | ||||||
| 8 | Myosine vertoont geen contractiliteit | er kan worden waargenomen dat na het toevoegen van ATP aan het myosine-geïnfundeerde systeem, er geen contractiliteit van de acto-myosine is. | Controleer of de myosineconcentratie of het zuiverheidsniveau goed is. Gebruik vers gerecycled myosine (gebruik binnen 6 weken na recycling). Het toevoegen van verse ATP aan de myosinemix kan helpen. Buffers ontgassen en zuurstofvangers gebruiken etc. kan het fotodegraat van de motoren verminderen. Verdere informatie is te vinden in de protocollen van Plastino et al. of Stam et al. van dezelfde methodenverzameling | ||||||
| 9 | Coverglass is niet hydrofiel | Coverglass wordt niet goed schoongemaakt. | Schoon hydrophilllic coverglas is cruciaal voor de vorming van lipide bilagen. Een nuttige, visuele uitlezing van de hydrofielheid van het dekglas na het reinigingsprotocol is om de bevochtiging van het glas door water te observeren. Voeg een klein volume water toe aan een platliggende deklip. Het water blijft in de vorm van een ronde druppel als de coverslip niet goed wordt schoongemaakt. Hetzelfde volume water zal zich echter verspreiden en een dunne laag vormen, op een behandeld hydrofiel dekglas. Dit bevochtigingsgedrag van het water op het afdekglasoppervlak kan worden gebruikt om vast te stellen of de reinigingsstappen met de reinigingsoplossing / NaOH hebben gewerkt. | ||||||
Tabel 2: Handleiding voor probleemoplossing met een overzicht van veelvoorkomende problemen en bijbehorende oplossingen.
Aanvullende video S1: Contractiele actomyosinestromen stimuleren lokale clustering van het membraan-actine linker eiwit HYE. TIRF-timelapse van HYE (YFP-tagged), actinefilamenten (gelabeld met Atto-635 maleimide) en myosine II-filamenten (gelabeld met Atto-565 maleimide) na toevoeging van myosine II aan een SLB die HYE en F-actine bevat. Tijd wordt bovenaan aangegeven: 0 min is onmiddellijk voordat fluorescerende myofilamenten in het TIRF-veld begonnen te verschijnen. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Dit protocol biedt een veelzijdig platform en een startpunt om experimenten te ontwerpen om de membraan-cortex interface van cellen te bestuderen. Kritieke stappen zijn de voorbereiding van schone glazen dia's, met behulp van verse lipiden voor efficiënte SUV-vorming (beide van invloed op de kwaliteit van SLB's), en het gebruik van vers gerecyclede myosine II-eiwitten voor dynamische actinefilamentreorganisatie. Bij beeldvormingsdynamiek over een lange tijd is het erg belangrijk om een zuurstofvangersysteem op te nemen (bijv. protocatechuïnezuur en protocatechuaat 3 4-dioxygenase 5,31).
Het ontwerp met open kamer maakt de sequentiële toevoeging van componenten aan een bestaand systeem mogelijk zonder lipidenstromen te induceren. Dit kan een belangrijk voordeel zijn ten opzichte van veelgebruikte benaderingen met gesloten kamers of werken met ingekapselde eiwitten binnen liposomen36. Tegengestelde effecten zoals eiwit-geïnduceerde membraanvervorming kunnen niet worden bestudeerd met glas-geadsorbeerde lipide bilayers.
De lipide bilayers kunnen worden gevormd met een breed scala aan lipidesamenstellingen. Het begint met adsorptie van de lipideblaasjes aan het hydrofiele glasoppervlak, gevolgd door spontane blaasjesruptuur als gevolg van oppervlakte-blaasje en directe vesikel-vesikelinteracties of de geadsorbeerde blaasjes die een kritische dekking bereiken waarna een klein deel van de blaasjes scheurt, actieve randen vormt, wat uiteindelijk leidt tot de bilayer-vorming32 . Naast glas kunnen verschillende substraten worden gebruikt om ondersteunde lipide-bilayers te vormen, zoals Mica (bijvoorbeeld voor atoomkrachtmicroscopie), zachte substraten (bijv. Poly-di-methyl-siloxaan), polymeerkussens33,34,35, verspreid tussen gaten van elektronenmicroscopierasters14. Droplet interface bilayers zijn een andere interessante methode om stabiele, vrijstaande lipide bilayers te creëren36. Het opnemen van acto-myosinenetwerken in blaasjes of emulsies is een zeer krachtige methode om dit minimale systeem te bestuderen in een celachtige geometrie37,38, en die elders in detail wordt beschreven39.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het AXA-onderzoeksfonds en het Warwick-Wellcome Quantitative Biomedicine Programme (Wellcome ISSF, RMRCB0058) voor DVK, NCBS-TIFR voor AB en ST, en de Wellcome-DBT Margdarshi fellowship (IA/M/15/1/502018) voor SM. DVK wil ook de Biophysical Society bedanken voor het mogelijk maken van het virtuele netwerkevenement "Challenges in understanding multi-component cytoskeletal networks from the molecular to the meso-scale", die heeft bijgedragen aan de totstandkoming van deze protocolcollectie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2 dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (lissamine rhodamine B sulfonyl) | Avanti Polar Lipids | 810158 | 16:0 RhoPE |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- [(N-(5-amino-1 carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids | 790404 | DGS-NTA-Ni2+ |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375 | DOPC |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850355 | DPPC |
| Amber glass vials | ThermoFisher | B7990-2A | |
| ATP disodium salt | Sigma Aldrich | A26209 | |
| Attofluor cell chamber | ThermoFisher | A7816 | |
| Bath sonicator | GT Sonic | 1860QTS | |
| beta-casein | Sigma Aldrich | C6905 | |
| CaCl2 | ThermoFisher | 12135 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 650471 | alternatively from Electron Microscopy Sciences, 50980296 |
| Cover slips, #1, 25 mm diameter, Gold Seal | Harvard Apparatus | 64-0705B | |
| Cover slips, #1, 40x22 mm, Gold Seal | ThermoFisher | 48404-031 | |
| EDTA | ThermoFisher | G12635 | |
| EGTA | Himedia | MB130 | |
| Gas tight glass syringes, with removebla needle, blunt, volumes 10 µL, 100 µL, 500 µL | Hammilton | 1700 series | |
| Hellmanex III | Hellma Analytics | Z805939 | cleaning solution |
| HEPES | Himedia | RM380 | |
| KaH2PO4 | ThermoFisher | G13405 | |
| KCl | ThermoFisher | G13305 | |
| KOH | ThermoFisher | G26708 | |
| Lipid extruder | Avanti Polar Lipids | 61000-1EA | |
| MgCl2 | ThermoFisher | G15535 | |
| Microtip sonicator | Sonics | VC750 | 3 mm Tip diameter |
| Na2CO3 | ThermoFisher | G15955 | |
| NaCl | Himedia | GRM853 | |
| NaH2PO4 | ThermoFisher | G15825 | |
| NaOH | ThermoFisher | G27815 | |
| Nikon Ti Eclipse TIRF microscope | Nikon | With a TIRF unit connected through a polarization-conserving optical fibre to an Agilent monolithic laser combiner MLC400 with multiple laser lines with a 100X, 1.45 NA Nikon Oil Objective with two 512 x 512-pixel EMCCD cameras (Photometrics Evolve 512) with a 100X, 1.45 NA Nikon Oil Objective with two 512 x 512-pixel EMCCD cameras (Photometrics Evolve 512) | |
| NOA88 | Norland Products | 8801 | |
| PTFE Coated Tweezer Style #2A | Structure Probe | 0S2AT-XD | |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Sucrose | ThermoFisher | G15925 | |
| UV-illuminator | Novascan | PSD PRO-UV | needs vacuum and O2 supply |
References
- Köster, D. V., Mayor, S. Cortical actin and the plasma membrane: Inextricably intertwined. Current Opinion in Cell Biology. 38, 81-89 (2016).
- Rao, M., Mayor, S. Active organization of membrane constituents in living cells. Current Opinion in Cell Biology. 29, 126-132 (2014).
- Honigmann, A., et al. A lipid bound actin meshwork organizes liquid phase separation in model membranes. eLife. 3, 01671 (2014).
- Das, A., et al. Stratification relieves constraints from steric hindrance in the generation of compact actomyosin asters at the membrane cortex. Science Advances. 6 (11), (2020).
- Köster, D. V., et al. Actomyosin dynamics drive local membrane component organization in an in vitro active composite layer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (12), 1645-1654 (2016).
- Vogel, S. K., Heinemann, F., Chwastek, G., Schwille, P. The design of MACs (minimal actin cortices). Cytoskeleton. 70 (11), 706-717 (2013).
- Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M.
- Mosby, L. S., et al. Myosin II filament dynamics in actin networks revealed with interferometric scattering microscopy. Biophysical Journal. 118 (8), 1946-1957 (2020).
- Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 4948 (2018).
- Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7, 12615 (2016).
- Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments. eLife. 2, 00116 (2013).
- Ditlev, J. A., et al. A composition-dependent molecular clutch between T cell signaling condensates and actin. eLife. 8, 42695 (2019).
- Banjade, S., Rosen, M. K. Phase transitions of multivalent proteins can promote clustering of membrane receptors. eLife. 3, 04123 (2014).
- Heinemann, F., Vogel, S. K., Schwille, P. Lateral membrane diffusion modulated by a minimal actin cortex. Biophysical Journal. 104 (7), 1465-1475 (2013).
- Vogel, S. K., Greiss, F., Khmelinskaia, A., Schwille, P. Control of lipid domain organization by a biomimetic contractile actomyosin cortex. eLife. 6, 24350 (2017).
- Block, S. Brownian motion at lipid membranes: A comparison of hydrodynamic models describing and experiments quantifying diffusion within lipid bilayers. Biomolecules. 8 (2), 30 (2018).
- JoVE, JoVE. JoVE Methods Collection. In vitro reconstitution of cytoskeleton networks for biomaterials, biophysics and active matter research. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).
- Pardee, J. D., Spudich, J. A.
- Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
- Pollard, T. D.
- JoVE Science Education Database.
- Bieling, P., et al. WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation. The EMBO Journal. 37 (1), 102-121 (2018).
- Shrivastava, R., Köster, D., Kalme, S., Mayor, S., Neerathilingam, M. Tailor-made ezrin actin binding domain to probe its interaction with actin in-vitro. PLoS One. 10 (4), 0123428 (2015).
- Nye, J. A., Groves, J. T. Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers. Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).
- Honigmann, A., et al. Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells. Nature Communications. 5, 5412 (2014).
- Selden, N. S., et al. Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides. Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).
- Seu, K. J., et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
- Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K., DiBenedetto, E. Simplified equation to extract diffusion coefficients from confocal FRAP data. Traffic. 13 (12), 1589-1600 (2012).
- Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K. A novel computational framework for D(t) from Fluorescence Recovery after Photobleaching data reveals various anomalous diffusion types in live cell membranes. Traffic. 20 (11), 867-880 (2019).
- Lorén, N., et al. Fluorescence recovery after photobleaching in material and life sciences: Putting theory into practice. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (3), 323-387 (2015).
- Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (7), 1-7 (2013).
- Andrecka, J., Spillane, K. M., Ortega-Arroyo, J., Kukura, P. Direct observation and control of Supported lipid bilayer formation with interferometric scattering microscopy. ACS Nano. 7 (12), 10662-10670 (2013).
- Lin, W. -C., et al. Supported membrane formation, characterization, functionalization, and patterning for application in biological science and technology. Current Protocols in Chemical Biology. 2 (4), 235-269 (2010).
- Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
- Sapuri-Butti, A. R., Butti, R. C., Parikh, A. N. Characterization of supported membranes on topographically patterned polymeric elastomers and their applications to microcontact printing. Langmuir. 23 (25), 12645-12654 (2007).
- Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
- Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236 (2022).
- Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), e63332 (2021).
- Murrell, M., Chen, S., Sun, Z. G. In vitro reconstitution of actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
