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신경과학

Somministrazione intracerebroventricolare di metaboliti microbici derivati dall'intestino in topi che si muovono liberamente

Published: June 02, 2022
doi:
10.3791/63972
, ,
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine,National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine,National Cheng Kung University

Summary

I metaboliti microbici derivati dall’intestino hanno effetti sfaccettati che portano a comportamenti complessi negli animali. Miriamo a fornire un metodo passo-passo per delineare gli effetti dei metaboliti microbici derivati dall’intestino nel cervello attraverso la somministrazione intracerebroventricolare tramite una cannula guida.

Abstract

L’impatto del microbiota intestinale e dei suoi metaboliti sulla fisiologia e sul comportamento dell’ospite è stato ampiamente studiato in questo decennio. Numerosi studi hanno rivelato che i metaboliti derivati dal microbiota intestinale modulano le funzioni fisiologiche mediate dal cervello attraverso intricati percorsi intestino-cervello nell’ospite. Gli acidi grassi a catena corta (SCFA) sono i principali metaboliti derivati dai batteri prodotti durante la fermentazione delle fibre alimentari dal microbioma intestinale. Gli SCFA secreti dall’intestino possono agire in più siti nella periferia, influenzando le risposte immunitarie, endocrine e neurali a causa della vasta distribuzione dei recettori SCFA. Pertanto, è difficile differenziare gli effetti centrali e periferici degli SCFA attraverso la somministrazione orale e intraperitoneale di SCFA. Questo articolo presenta un metodo basato su video per interrogare il ruolo funzionale degli SCFA nel cervello tramite una cannula guida in topi che si muovono liberamente. La quantità e il tipo di SCFA nel cervello possono essere regolati controllando il volume e la velocità di infusione. Questo metodo può fornire agli scienziati un modo per apprezzare il ruolo dei metaboliti derivati dall’intestino nel cervello.

Introduction

Il tratto gastrointestinale umano ospita diversi microrganismi che colpiscono l’ospite 1,2,3. Questi batteri intestinali possono secernere metaboliti derivati dall’intestino durante il loro utilizzo di componenti dietetici consumati dall’ospite 4,5. È interessante notare che i metaboliti intestinali non metabolizzati nella periferia possono essere trasportati ad altri organi attraverso la circolazione6. Da notare, questi metaboliti secreti possono servire come mediatori per l’asse intestino-cervello, definito come la comunicazione bidirezionale tra il sistema nervoso centrale e l’intestino7. Studi precedenti hanno dimostrato che i metaboliti derivati dall’intestino possono modulare il comportamento complesso e le emozioni negli animali 8,9,10,11.

Gli acidi grassi a catena corta (SCFA) sono i principali metaboliti prodotti dal microbiota intestinale durante la fermentazione della fibra alimentare e dei carboidrati indigeribili6. Acetato, propionato e butirrato sono gli SCFA più abbondanti nell’intestino12. Gli SCFA servono come fonte di energia per le cellule del tratto gastrointestinale. Gli SCFA non metabolizzati nell’intestino possono essere trasportati al cervello attraverso la vena porta, modulando così il cervello e il comportamento 6,12. Studi precedenti hanno suggerito che gli SCFA potrebbero svolgere un ruolo critico nei disturbi neuropsichiatrici 6,12. Ad esempio, l’iniezione intraperitoneale di butirrato nei topi BTBR T + Itpr3tf / J (BTBR), un modello animale di disturbo dello spettro autistico (ASD), ha salvato i loro deficit sociali13. I ratti trattati con antibiotici che ricevevano microbiota da soggetti depressivi hanno mostrato un aumento dei comportamenti ansiosi e degli SCFA fecali14. Clinicamente, sono state osservate alterazioni dei livelli di SCFA fecale nelle persone con ASD rispetto ai controlli tipicamente in via di sviluppo15,16. Le persone con depressione hanno livelli di SCFA fecali più bassi rispetto ai soggetti sani17,18. Questi studi hanno suggerito che gli SCFA possono alterare il comportamento negli animali e negli esseri umani attraverso vari percorsi.

I metaboliti microbici esercitano diversi effetti su più siti nel corpo, influenzando la fisiologia e i comportamenti dell’ospite 4,19, tra cui il tratto gastrointestinale, il nervo vago e il nervo simpatico. È difficile individuare il ruolo preciso dei metaboliti derivati dall’intestino nel cervello quando si somministrano i metaboliti per vie periferiche. Questo articolo presenta un protocollo basato su video per studiare gli effetti dei metaboliti derivati dall’intestino nel cervello di un topo che si muove liberamente (Figura 1). Abbiamo dimostrato che gli SCFA potrebbero essere somministrati acutamente attraverso la cannula guida durante i test comportamentali. Il tipo, il volume e la velocità di infusione dei metaboliti possono essere modificati a seconda dello scopo. Il sito di incannulizzazione può essere regolato per esplorare l’impatto dei metaboliti intestinali in una specifica regione del cervello. Miriamo a fornire agli scienziati un metodo per esplorare il potenziale impatto dei metaboliti microbici derivati dall’intestino sul cervello e sul comportamento.

Protocol

Tutti i protocolli sperimentali e la cura degli animali sono stati approvati dal National Cheng Kung University (NCKU) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Preparazione per l’animale da esperimento Ottieni topi maschi selvatici C57BL / 6JNarl di 6-8 settimane da un fornitore. Ospitare i topi in una gabbia per topi standard con mouse chow standard e acqua sterilizzata ad libitum.NOTA: Le condizioni di alloggio per il Laborator…

Representative Results

Il topo è stato infuso con SCFA 1 settimana dopo il recupero dall’impianto della cannula guida per valutare l’attività locomotoria in una nuova gabbia. Il topo è stato posto in una nuova gabbia e infuso con 2.100 nL di SCFA o ACSF nei primi 5 minuti (velocità di consegna di 7 nL / s) nel cervello attraverso la cannula guida commerciale impiantata nel ventricolo laterale del cervello. L’attività locomotoria in una nuova gabbia è stata registrata per altri 30 minuti dopo l’infusione. Nessuna differenza è stata osser…

Discussion

I metaboliti derivati dall’intestino sono stati associati a malattie mediate dal cervello senza un meccanismo molto preciso, in parte a causa dei loro molteplici siti di legame nel corpo 6,12,24. Rapporti precedenti hanno indicato che gli SCFA potrebbero servire come ligandi per i recettori accoppiati alle proteine G, regolatori epigenetici e fonti per la produzione di energia in più siti nel corpo …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Riconosciamo il personale del Laboratory Animal Center della National Cheng Kung University (NCKU) per la cura degli animali. Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio del Prof. Kun-Yen Huang Education Fund della CHENG-HSING Medical Foundation a C.-W.L.; i fondi del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST) di Taiwan: (Ricerca universitaria MOST 109-2813-C-006-095-B) a T.-H.Y.; (MOST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) a W.-L.W.; e l’Higher Education Sprout Project, Ministero della Pubblica Istruzione alla sede dell’avanzamento universitario presso NCKU a W.-L.W.

Materials

Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383
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Liou, C., Yao, T., Wu, W. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).
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