Os metabólitos microbianos derivados do intestino têm efeitos multifacetados, levando a um comportamento complexo em animais. Nosso objetivo é fornecer um método passo-a-passo para delinear os efeitos dos metabólitos microbianos derivados do intestino no cérebro através da entrega intracerebroventricular através de uma cânula guia.
O impacto da microbiota intestinal e seus metabólitos na fisiologia e no comportamento do hospedeiro tem sido extensivamente investigado nesta década. Numerosos estudos revelaram que os metabólitos derivados da microbiota intestinal modulam as funções fisiológicas mediadas pelo cérebro através de intrincadas vias intestino-cérebro no hospedeiro. Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) são os principais metabólitos derivados de bactérias produzidos durante a fermentação de fibras alimentares pelo microbioma intestinal. Os AGCCs secretados do intestino podem atuar em vários locais da periferia, afetando as respostas imunológicas, endócrinas e neurais devido à vasta distribuição de receptores SCFAs. Portanto, é um desafio diferenciar os efeitos centrais e periféricos dos AGCCs por meio da administração oral e intraperitoneal de AGCC. Este artigo apresenta um método baseado em vídeo para interrogar o papel funcional dos AGCCs no cérebro através de uma cânula guia em camundongos em movimento livre. A quantidade e o tipo de AGCCs no cérebro podem ser ajustados controlando o volume e a taxa de infusão. Este método pode fornecer aos cientistas uma maneira de apreciar o papel dos metabólitos derivados do intestino no cérebro.
O trato gastrointestinal humano abriga diversos microrganismos que impactam o hospedeiro 1,2,3. Essas bactérias intestinais podem secretar metabólitos derivados do intestino durante a utilização de componentes dietéticos consumidos pelo hospedeiro 4,5. Curiosamente, os metabólitos intestinais não metabolizados na periferia podem ser transportados para outros órgãos via circulação6. Vale ressaltar que esses metabólitos secretados podem servir como mediadores para o eixo intestino-cérebro, definido como a comunicação bidirecional entre o sistema nervoso central e o intestino7. Estudos prévios mostraram que metabólitos derivados do intestino podem modular o comportamento complexo e a emoção em animais 8,9,10,11.
Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) são os principais metabólitos produzidos pela microbiota intestinal durante a fermentação de fibras alimentares e carboidratos indigestos6. Acetato, propionato e butirato são os AGCCs mais abundantes no intestino12. Os AGCCs servem como fonte de energia para as células do trato gastrointestinal. AGCCs não metabolizados no intestino podem ser transportados para o cérebro através da veia porta, modulando assim o cérebro e o comportamento 6,12. Estudos prévios sugeriram que os AGCCs podem desempenhar um papel crítico nos transtornos neuropsiquiátricos 6,12. Por exemplo, a injeção intraperitoneal de butirato em camundongos BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR), um modelo animal de transtorno do espectro autista (TEA), resgatou seus déficits sociais13. Ratos tratados com antibióticos que receberam microbiota de indivíduos depressivos mostraram um aumento nos comportamentos semelhantes à ansiedade e nos AGCCs fecais14. Clinicamente, alterações nos níveis de AGCCs fecais foram observadas em pessoas com TEA em comparação com controles com desenvolvimento típico15,16. Pessoas com depressão apresentam níveis mais baixos de AGCCs fecais do que indivíduos saudáveis17,18. Esses estudos sugeriram que os AGCCs podem alterar o comportamento em animais e humanos através de várias rotas.
Os metabólitos microbianos exercem diversos efeitos em múltiplos locais do corpo, impactando a fisiologia e os comportamentos do hospedeiro 4,19, incluindo o trato gastrointestinal, o nervo vago e o nervo simpático. É difícil identificar o papel preciso dos metabólitos derivados do intestino no cérebro ao administrar os metabólitos por vias periféricas. Este trabalho apresenta um protocolo baseado em vídeo para investigar os efeitos de metabólitos derivados do intestino no cérebro de um rato em movimento livre (Figura 1). Mostramos que os AGCCs poderiam ser administrados agudamente através da cânula-guia durante os testes comportamentais. O tipo, o volume e a taxa de infusão de metabólitos podem ser modificados dependendo da finalidade. O local da canulização pode ser ajustado para explorar o impacto dos metabólitos intestinais em uma região específica do cérebro. Nosso objetivo é fornecer aos cientistas um método para explorar o impacto potencial dos metabólitos microbianos derivados do intestino no cérebro e no comportamento.
Metabólitos derivados do intestino têm sido associados a doenças mediadas pelo cérebro sem muito mecanismo preciso, em parte devido aos seus múltiplos sítios de ligação no organismo 6,12,24. Relatos anteriores indicaram que os AGCCs poderiam servir como ligantes para receptores acoplados à proteína G, reguladores epigenéticos e fontes de produção de energia em múltiplos locais do organismo <…
The authors have nothing to disclose.
Reconhecemos a equipe do Centro de Animais de Laboratório da Universidade Nacional de Cheng Kung (NCKU) por cuidar dos animais. Este trabalho foi apoiado pela bolsa de estudos do Prof. Kun-Yen Huang Education Fund da CHENG-HSING Medical Foundation para C.-W.L.; os fundos do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST) em Taiwan: (Iniciação Científica MOST 109-2813-C-006-095-B) para T.-H.Y.; (MAIS 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) a W.-L.W.; e o Projeto Sprout de Ensino Superior, do Ministério da Educação para a Sede do Avanço Universitário na NCKU para W.-L.W.
Material | |||
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 | Pfizer | n/a | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | A-21206 | |
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) | Millipore | AB153-I | |
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile | NEST | 121921LA01 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | ACSF: 0.14 g/L |
Chlorhexidine scrub 2% | Phoenix | NDC 57319-611-09 | |
Chlorhexidine solution | Phoenix | NDC 57319-599-09 | |
Commercial dummy | RWD Life Science | 62004 | Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm |
Commercial guide cannul | RWD Life Science | 62104 | Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm |
Commercial injector | RWD Life Science | 62204 | Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | ACSF: 0.61 g/L |
Dental acrylic | HYGENIC | n/a | |
Fixing screws | RWD Life Science | 62521 | |
Fluoroshield mounting medium with DAPI | Abcam | AB104139 | |
Horse serum | ThermoFisher Scientific | 16050130 | |
Insulin syringes | BBraun | XG-LBB-9151133S-1BX | 1 mL |
Isoflurane | Panion & BF biotech | DG-4900-250D | |
KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | ACSF: 0.19 g/L |
Ketoprofen | Swiss Pharmaceutical | n/a | |
Lidocaine | AstraZeneca | n/a | |
Low melting point agarose | Invitrogen | 16520 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | ACSF: 0.19 g/L |
Microscope cover slips | MARIENFELD | 101242 | |
Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001E | |
Mineral oil light, white NF | Macron Fine Chemicals | MA-6358-04 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | ACSF: 7.46 g/L |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | ACSF: 0.18 g/L |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | ACSF: 1.76 g/L |
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) | 3M | 1469SB | 3M Vetbond |
Neural tracer | Santa Cruz | SC-358883 | FluoroGold |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Polyethylene tube | RWD Life Science | 62329 | OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm |
Puralube Vet (eye) Ointment | Dechra | 12920060 | |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | SCFAs: 13.5 mM |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | SCFAs: 8 mM |
Sodium propionate | Sigma-Aldrich | P1880 | SCFAs: 5.18 mM |
Stainless guide cannula | Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. | n/a | OD 0.63 mm; Local vendor |
Stainless injector | Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. | n/a | OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor |
Superglue | Krazy Glue | KG94548R | |
Triton X-100 | Merck | 1.08603.1000 | |
Equipment | |||
Cannula holder | RWD Life Science | B485-68217 | |
Ceiling camera | FOSCAM | R2 | |
Digital stereotaxic instruments | Stoelting | 51730D | |
Dissecting microscope | INNOVIEW | SEM-HT/TW | |
Glass Bead Sterilizer | RWD Life Science | RS1501 | |
Heating pad | Stoelting | 53800M | |
Leica microscope | Leica | DM2500 | |
Micro Dissecting Forceps | ROBOZ | RS-5136 | Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length |
Micro Dissecting Scissors | ROBOZ | RS-5918 | 4.5" Angled Sharp |
Microinjection controller | World Precision Instruments (WPI) | MICRO2T | SMARTouch Controller |
Microinjection syringe pump | World Precision Instruments (WPI) | UMP3T-1 | UltraMicroPump3 |
Microliter syringe | Hamilton | 80014 | 10 µL |
Optical Fiber Cold Light with double Fiber | Step | LGY-150 | Local vendor |
Pet trimmer | WAHL | 09962-2018 | |
Vaporiser for Isoflurane | Step | AS-01 | Local vendor |
Vibratome | Leica | VT1000S | |
Software | |||
Animal behavior video tracking software | Noldus | EthoVision | Version: 15.0.1416 |
Leica Application Suite X software | Leica | LASX | Version: 3.7.2.22383 |