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Immunology and Infection

केनोरहाब्डिस एलिगेंस आंतों में माइक्रोबियल औपनिवेशीकरण और संक्रमण की कल्पना करने के लिए सीटू संकरण (फिश) में आरएनए फ्लोरेसेंस

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/63980
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Biology, San Diego State University, 2School of Biological Sciences, University of California, San Diego

Summary

आंतों के रोगाणुओं, जिसमें बाह्य बैक्टीरिया और इंट्रासेल्युलर रोगजनकों जैसे ओरसे वायरस और माइक्रोस्पोरिडिया (कवक) शामिल हैं, अक्सर जंगली केनोरहाब्डिस नेमाटोड से जुड़े होते हैं। यह लेख उन रोगाणुओं का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो सी एलिगेंस नेमाटोड को उपनिवेशित और / या संक्रमित करते हैं, और प्रयोगशाला में नियंत्रित संक्रमण के बाद रोगज़नक़ भार को मापने के लिए।

Abstract

जंगली केनोरहाब्डिस नेमाटोड की आंतों में विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मजीवों का निवास होता है, जिसमें आंत माइक्रोबायोम बैक्टीरिया और रोगजनकों, जैसे माइक्रोस्पोरिडिया और वायरस शामिल हैं। केनोरहाब्डिस एलिगेंस और स्तनधारी आंतों की कोशिकाओं के बीच समानता के साथ-साथ सी एलिगेंस प्रणाली की शक्ति के कारण, यह मेजबान विवो में मेजबान आंत-माइक्रोब इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है। हालांकि उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ इन इंटरैक्शन के कुछ पहलुओं का निरीक्षण करना संभव है, रोगाणुओं को सटीक रूप से वर्गीकृत करना और अधिक सटीक उपकरणों के बिना उपनिवेश या संक्रमण की सीमा को चिह्नित करना मुश्किल है। आरएनए फ्लोरेसेंस इन सीटू संकरण (फिश) का उपयोग जंगली से नेमाटोड में रोगाणुओं की पहचान और कल्पना करने या प्रयोगशाला में रोगाणुओं से संक्रमित नेमाटोड में संक्रमण को प्रयोगात्मक रूप से चिह्नित करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया जा सकता है। मछली जांच, अत्यधिक प्रचुर मात्रा में छोटे सबयूनिट राइबोसोमल आरएनए को लेबल करते हुए, बैक्टीरिया और माइक्रोस्पोरिडियन कोशिकाओं के लिए एक उज्ज्वल संकेत उत्पन्न करते हैं। कई प्रजातियों के लिए आम राइबोसोमल आरएनए के संरक्षित क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन की गई जांच रोगाणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला का पता लगा सकती है, जबकि राइबोसोमल आरएनए के अलग-अलग क्षेत्रों को लक्षित करना संकरा पता लगाने के लिए उपयोगी है। इसी तरह, वायरल आरएनए को लेबल करने के लिए जांच को डिज़ाइन किया जा सकता है। पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) या एसीटोन निर्धारण के साथ आरएनए फिश धुंधला करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। पीएफए निर्धारण बैक्टीरिया, माइक्रोस्पोरिडिया और वायरस से जुड़े नेमाटोड के लिए आदर्श है, जबकि एसीटोन निर्धारण माइक्रोस्पोरिडा बीजाणुओं के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए आवश्यक है। जानवरों को पहले धोया गया और पैराफॉर्मलडिहाइड या एसीटोन में तय किया गया। निर्धारण के बाद, वांछित लक्ष्य तक जांच के संकरण की अनुमति देने के लिए फिश जांच को नमूनों के साथ इनक्यूबेट किया गया था। जानवरों को फिर से धोया गया और फिर माइक्रोस्कोप स्लाइड पर या स्वचालित दृष्टिकोण का उपयोग करके जांच की गई। कुल मिलाकर, यह फिश प्रोटोकॉल सी एलिगेंस आंत में रहने वाले रोगाणुओं का पता लगाने, पहचान करने और परिमाणीकरण करने में सक्षम बनाता है, जिसमें रोगाणु भी शामिल हैं जिनके लिए कोई आनुवंशिक उपकरण उपलब्ध नहीं हैं।

Introduction

केनोरहाब्डिस एलिगेंस आंतों केउपकला कोशिकाओं में जन्मजात प्रतिरक्षा और मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है। एक पारदर्शी शरीर और केवल 20 आंतों की कोशिकाओं के कारण, सी एलिगेंस एक बरकरार जीव के संदर्भ में माइक्रोबियल आंतों के उपनिवेशीकरण और संक्रमण की प्रक्रियाओं की निगरानी के लिए एक सुविधाजनक प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है। नेमाटोड आंतों की कोशिकाएं स्तनधारी आंतों के उपकला कोशिकाओं के साथ कई रूपात्मक और कार्यात्मक समानताएं साझा करती हैं, जिससे उन्हें माइक्रोबायोम उपनिवेशऔर रोगज़नक़ संक्रमण 3,4,5,6 को नियंत्रित करने वाली प्रक्रियाओं के विच्छेदन के लिए विवो मॉडल में एक वापस लेने योग्य बना दिया जाता है।

एलिगेंस विभिन्न प्रकार के रोगाणुओं पर फ़ीड करते हैं जो आंत को उपनिवेशित और संक्रमित करते हैं, और इन नेमाटोड के नमूने के परिणामस्वरूप वायरस, यूकेरियोट्स (कवक, ओमाइसेट्स), और बैक्टीरिया की खोज हुई है जो स्वाभाविक रूप से इस मेजबान 7,8,9,10 के साथ जुड़ते हैं। ओरसे वायरस आंत को संक्रमित करता हुआ पाया गया था और वर्तमान में सी एलिगेंस9 का एकमात्र ज्ञात प्राकृतिक वायरस है। माइक्रोस्पोरिडिया फंगल से संबंधित इंट्रासेल्युलर रोगजनकों को बाध्य करते हैं जो जंगली-पकड़े गए केनोरहाब्डिटिस में सबसे अधिक पाए जाने वाले संक्रमण हैं, जिसमें कई प्रजातियों को सी एलिगेंस और संबंधित नेमाटोड 8,11 को संक्रमित करने की खोज की गई है। कई बैक्टीरिया आमतौर पर जंगली पकड़े गए सी एलिगेंस के आंतों के लुमेन में निवास करते हुए पाए जाते हैं और कई प्रजातियों को सी एलिगेंस माइक्रोबायोम (सीईएमबियो) 6,12,13,14 के लिए एक प्राकृतिक मॉडल के रूप में स्थापित किया गया है। एलिगेंस को स्वाभाविक रूप से उपनिवेशित और / या संक्रमित करने वाले रोगाणुओं की खोज और विशेषता इन मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन को नियंत्रित करने वाले आनुवंशिक तंत्र को समझने के लिए आवश्यक है, साथ ही साथ नई माइक्रोबियल प्रक्रियाओं की कल्पना करना जो केवल एक बरकरार मेजबान जानवर के संदर्भ में होते हैं।

नमूना लेने के बाद, जंगली नेमाटोड को विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी के माध्यम से जांच की जाती है ताकि फेनोटाइप ्स की तलाश की जा सके जो संक्रमण या उपनिवेशीकरण का संकेत देते हैं। उदाहरण के लिए, आंतों की कोशिकाओं की रूढ़िवादी दानेदार उपस्थिति में परिवर्तन एक इंट्रासेल्युलर परजीवी संक्रमण 8 की उपस्थिति से जुड़ा हो सकताहै। विशेष रूप से, आंत के कणिकाओं का नुकसान और साइटोसोलिक चिपचिपाहट में कमी वायरल संक्रमण के संकेत हैं, जबकि आंत के कणिकाओं का 'खांचे' में पुनर्गठन जीनस नेमाटोसिडा 8,9 में माइक्रोस्पोरिडिया के साथ संक्रमण का संकेत दे सकता है। चूंकि जंगली सी एलिगेंस नमूनों में रोगाणुओं की एक विस्तृत विविधता मौजूद है, इसलिए डीआईसी माइक्रोस्कोपी के माध्यम से रोगाणुओं के बीच अंतर करना मुश्किल हो सकता है। मेजबान के भीतर रोगाणुओं के स्थानिक वितरण के बारे में जानकारी भी कई रोगाणुओं के छोटे आकार के कारण पता लगाना मुश्किल होसकता है। इसके अतिरिक्त, विट्रो में रुचि के किसी भी विशेष रोगाणुओं की खेती हमेशा संभव नहीं होती है, जिससे पता लगाने और / या परिमाणीकरण में कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है।

आरएनए फ्लोरेसेंस इन सीटू संकरण (फिश) फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करके रोगाणुओं को फ्लोरोसेंटली लेबल करने की एक विधि प्रदान करता है जो निश्चित कोशिकाओं में छोटे राइबोसोमल सबयूनिट (एसएसयू) के आरएनए से जुड़ता है। यदि रूपात्मक विशेषताओं का विश्लेषण माइक्रोब के एक विशेष वर्ग का सुझाव देता है, तो फिश जांच जो ऐसे रोगाणुओं के विशिष्ट या व्यापक वर्गों को लक्षित करती है, का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, EUB338 को बैक्टीरियल एसएसयू के लिए एक सार्वभौमिक जांच माना जाता है और आमतौर पर बैक्टीरिया16 की एक विस्तृत श्रृंखला का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल एकल-फंसे हुए डीएनए जांच का उपयोग करता है जो फ्लोरोफोरे के साथ अंत-लेबल होते हैं और विशेष रूप से रुचि के माइक्रोब के लक्ष्य एसएसयू के पूरक होने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं, हालांकि पहले से डिज़ाइन की गईजांच उपलब्ध हैं। रोगाणुओं के एसएसयू को लक्षित करने का मुख्य लाभ इस आरएनए की अपेक्षाकृत बड़ी बहुतायत है, जिसमें आमतौर पर सेल में सभी आरएनए का 80% -90% शामिल होता है, जिससे बहुत अधिक सिग्नल-टू-शोर अनुपात17 के साथ धुंधला हो जाता है। प्रोब्स को ऑरसे वायरस 9,18 की तरह वायरस का पता लगाने के लिए आरएनए को लक्षित करने के लिए भी डिज़ाइन किया जा सकता है, जो अक्सर संक्रमित कोशिकाओं में बहुत अधिक प्रतियों में मौजूद होते हैं यदि वायरस सक्रिय रूप से प्रतिकृति बना रहा है।

ज्ञात जांच के साथ परिणामों के आधार पर, सीटू में प्रजातियों की पुष्टि के लिए अधिक विशिष्ट जांच डिजाइन करने के लिए आगे अनुक्रम जानकारी प्राप्त करना आवश्यक हो सकता है। एक सामान्य दृष्टिकोण एसएसयू के संरक्षित क्षेत्रों (बैक्टीरिया के लिए 16 एस और यूकेरियोट्स के लिए 18 एस) के खिलाफ सार्वभौमिक प्राइमरों का उपयोग करना है ताकि (पीसीआर के माध्यम से) क्षेत्रों को बढ़ायाजा सके जो अधिक भिन्न हैं। इस अनुक्रम जानकारी का उपयोग करके, अधिक प्रजाति-विशिष्टता के साथ जांच तैयार की जा सकती है। ये मछली जांच तब संस्कृति-स्वतंत्र तरीके से रोगाणुओं की पहचान को सक्षम कर सकतीहै। इसके अतिरिक्त, आरएनए फिश अद्वितीय रूपात्मक उपनिवेशऔर संक्रमण विशेषताओं में अंतर्दृष्टि दे सकता है, जिसमें फिलामेंटेशन या ऊतक स्थानीयकरण पैटर्न19,20 शामिल हैं। विभिन्न रंगीन मछली जांच का उपयोग एक साथ किया जा सकता है, जो जंगली नेमाटोड नमूनों में रोगाणुओं के बीच दृश्य भेद के साथ-साथ मेजबान15,20 के अंदर माइक्रोब-माइक्रोब गतिशीलता के अवलोकन की अनुमति देता है। इसके अलावा, आरएनए फिश स्टेनिंग को मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन अध्ययनों पर लागू किया जा सकता है जहां एक ज्ञात प्रजाति के संक्रमण और उपनिवेशीकरण को आसानी से मैन्युअल रूप से या रोगज़नक़ लोड पर अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए स्वचालित दृष्टिकोण के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, सी एलिगेंस उत्परिवर्ती की तुलना में, जिन्होंने संक्रमणके प्रतिरोध में वृद्धि या कमी की है।

Protocol

नोट: नेमाटोड को पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान (पीएफए) या एसीटोन के साथ तय किया जा सकता है। पीएफए एसीटोन की तुलना में आकृति विज्ञान के बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है और ट्रांसजेनिक ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) से संकेतों को संरक्षित कर सकता है, जो एसीटोन द्वारा नष्ट हो जाता है। हालांकि, इस जीवन चरण को लेबल करने में सक्षम करने के लिए माइक्रोस्पोरिडियन बीजाणुओं को स्थिर करने के लिए एसीटोन निर्धारण आवश्यक है। इसके अलावा, एसीटोन पीएफए की तुलना में अधिक सुविधाजनक हो सकता है क्योंकि यह कम विषाक्त है, और फिक्सेटिव को हटाने की आवश्यकता के बिना -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एसीटोन में कई दिनों तक नमूने संग्रहीत किए जा सकते हैं। नीचे दो अलग-अलग प्रोटोकॉल हैं, या तो पीएफए समाधान या एसीटोन को फिक्सेटिव के रूप में उपयोग करते हुए। प्रोटोकॉल चरणों के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, चित्रा 1 देखें।

1. पीएफए निर्धारण के साथ मछली धुंधला होना

  1. संबंधित रोगाणुओं के साथ नेमाटोड तैयार करें
    1. मानक नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) प्लेटों पर रुचि के वांछित माइक्रोब के साथ नेमाटोड उगाएं जो उपयुक्त खाद्य स्रोत के साथ बीज ति हैं। वांछित जीवन चरण तक पहुंचने तक नेमाटोड को 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. एम 9 न्यूनतम लवण मीडिया के 2 एमएल जोड़ें (42 एमएम एनए2एचपीओ4, 22 एमएम केएच2पीओ4, 8.6 एमएम एनएसीएल, 19 एमएम एनएच4सीएल) + 0.1% ट्वीन 20 एनजीएम प्लेटों में जिसमें केनोरहाब्डाइटिस स्ट्रेन संक्रमित या वांछित माइक्रोब के साथ उपनिवेशित होता है।
      नोट: डिटर्जेंट के अलावा नेमाटोड को पिपेट और माइक्रोफ्यूज ट्यूबों से चिपकने से रोकने के लिए है, और पेलेट एल 1-एल 2 चरण नेमाटोड में मदद करने के लिए है। ट्वीन 20 के स्थान पर 0.1% ट्राइटन-एक्स का उपयोग किया जा सकता है।
    3. पाइप ने एक ग्लास पाश्चर पिपेट और बल्ब का उपयोग करके प्लेटों से नेमाटोड को ऊपर उठाएं, और उन्हें चिह्नित 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
      नोट: ग्लास पिपेट को प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि नेमाटोड प्लास्टिक पिपेट से चिपक सकते हैं, लेकिन डिटर्जेंट (ट्वीन 20 या ट्राइटन-एक्स) के अलावा इस समस्या को कम किया जा सकता है।
    4. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके, एल 1 जानवरों के लिए 60 एस के लिए 2,000 x g पर उपनिवेशित या संक्रमित नेमाटोड वाले नमूनों को स्पिन करें, या एल 4 या वयस्क जानवरों के लिए 60 s के लिए 500 x g । बाद के सभी सेंट्रीफ्यूजेशन चरण चयनित गति पर किए जाएंगे।
    5. पिपेट का उपयोग करके माइक्रोफ्यूज ट्यूबों से सुपरनैटेंट को हटा दें। नेमाटोड गोली को गोली के ऊपर 100 μL तक सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटाकर परेशान करने से बचें। यह चिह्नित 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों का उपयोग करके अनुमान लगाया जा सकता है।
  2. बाहरी संदूषण को खत्म करने के लिए निमेटोड धोएं
    1. माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में 1x PBS का 1 mL (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4) + 0.1% ट्वीन 20 (PBS-T) जोड़ें।
    2. नमूनों को उचित गति से माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में स्पिन करें (चरण 1.1.4 देखें)। पिपेट का उपयोग करके, सतह पर तैरने वाले के 100 μL को छोड़कर सभी को हटा दें। यह चिह्नित 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों का उपयोग करके अनुमान लगाया जा सकता है।
    3. उपरोक्त दो चरणों 2-3x को दोहराएं।
      नोट: तीन कुल धोने आमतौर पर पर्याप्त होते हैं; हालांकि, किसी भी अतिरिक्त बाहरी संदूषण को हटाने के लिए अतिरिक्त धोए जा सकते हैं।
  3. PFA के साथ नेमाटोड ठीक करें
    1. फ्यूम हुड में, 4% पीएफए की अंतिम सांद्रता के लिए चरण 1.2.3 से प्राप्त नेमाटोड गोली के ऊपर 100 μL सुपरनैटेंट युक्त माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 16% PFA का 33 μL जोड़ें।
      सावधानी: पीएफए एक कार्सिनोजेन है। पीएफए के संपर्क में त्वचा संवेदीकरण और जलन और आंखों की क्षति हो सकती है। पीएफए जहरीले धुएं को छोड़ता है जिससे श्वसन जलन या संवेदीकरण हो सकता है। पीएफए का उपयोग करते समय, उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण के साथ एक फ्यूम हुड में काम करें और उपयोग से पहले उचित सुरक्षा डेटा शीट का उल्लेख करें।
    2. कमरे के तापमान पर 30-45 मिनट के लिए नेमाटोड के उपनिवेशित या संक्रमित माइक्रोब से संक्रमित नमूनों को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन बाद, नमूनों को 70% इथेनॉल में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि प्रोटोकॉल जारी रखने के लिए तैयार न हो।
      नोट: समय के साथ पीएफए द्वारा जीएफपी के क्षरण के कारण ट्रांसजेनिक उपभेदों में जीएफपी सिग्नल को बनाए रखने के लिए एक छोटी इनक्यूबेशन अवधि बेहतर है। लंबे इनक्यूबेशन समय फिक्सेटिव को नमूनों में बेहतर ढंग से पारगम्यता की अनुमति देता है। नमूने के आधार पर अनुभवजन्य रूप से इनक्यूबेशन समय निर्धारित करना सबसे अच्छा है।
  4. PFA समाधान निकालें
    1. नमूनों को उचित गति से माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में स्पिन करें (चरण 1.1.4 देखें)। पिपेट के साथ, गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना सतह पर तैरने वाला निकालें।
      चेतावनी: सतह पर तैरने वाले में पीएफए होता है, जो विषाक्त होता है। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और कम से कम पहले दो धोने को फ्यूम हुड में जहरीले कचरे के रूप में धो लें।
    2. माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में नमूने में पीबीएस-टी के 0.5 एमएल जोड़ें।
    3. PBS-T के साथ चरण 1.4.1 और 1.4.2 2-3x का पालन करें और दोहराएँ।
      नोट: अधिक धोने का प्रदर्शन पृष्ठभूमि संकेत को कम करने में मदद करेगा। कुल मिलाकर कम से कम चार धोने की सिफारिश की जाती है।
    4. अंतिम धोने के बाद, नमूनों को नीचे घुमाएं और सतह पर तैरने वाले को हटा दें, जिससे गोली अबाधित हो जाए।
  5. संकरण बफर (एचबी) तैयार करें और नेमाटोड को धो लें
    1. प्रति नमूना 1 एमएल एचबी (900 एमएम एनएसीएल, 20 एमएम ट्राइस पीएच 7.5, 0.01% एसडीएस) तैयार करें।
      नोट: वर्षा से बचने के लिए प्रत्येक उपयोग से पहले एचबी को ताजा तैयार किया जाना चाहिए। हालांकि, एक सामान्य बफर (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5) अग्रिम में बनाया जा सकता है और एचबी की आवश्यकता होने तक कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है। उपयोग से पहले, सामान्य बफर के प्रति नमूना 1 एमएल तैयार करें और एसडीएस को 0.01% की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।
    2. नेमाटोड गोली युक्त माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में 800 μL HB जोड़ें। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में नमूने को पेलेट करें (चरण 1.1.4 देखें)। गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  6. वांछित लक्ष्य अनुक्रम के लिए मछली जांच को हाइब्रिड करें
    1. तैयार एचबी के प्रति नमूने 100 μL को वांछित फिश जांच के साथ 5-10 ng / μL जांच की अंतिम एकाग्रता में मिलाएं।
      नोट: फिश प्रोब 15-23-मेर ऑलिगोस हैं, जो रुचि के माइक्रोब के एसएसयू के लिए एंटीसेंस हैं, और 5 ' या 3 ' अंत से जुड़े रंगीन फ्लोरोफोरे के साथ लेबल किए गए हैं (यहां उपयोग की जाने वाली जांच के लिए तालिका 1 देखें)। आम तौर पर, स्टॉक फिश प्रोब 1 मिलीग्राम / एमएल पर संग्रहीत किए जाते हैं।
    2. प्रत्येक नमूने में मछली जांच युक्त एचबी का 100 μL जोड़ें। ट्यूबों को धीरे से फ्लिक या इनवर्ट करके मिलाएं।
      नोट: एक ही नमूने में कई फ्लोरोसेंट संकेतों की कल्पना करने के लिए विभिन्न रंगीन मछली जांच को एक साथ जोड़ा जा सकता है (चित्रा 1 बी देखें)।
    3. नमूनों को रात भर (6-24 घंटे) 46-54 डिग्री सेल्सियस पर सूखे स्नान में या 1,200 आरपीएम पर 46-54 डिग्री सेल्सियस पर थर्मल मिक्सर में इनक्यूबेट करें।
      नोट: 46-48 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन आमतौर पर संकरण के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, इस तापमान को फिश जांच के पिघलने के तापमान के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। सामान्य तौर पर, संकरण तापमान पिघलने के तापमान से 4 डिग्री सेल्सियस नीचे होता है।
  7. मछली जांच को हटा दें और नेमाटोड धो लें
    1. प्रति नमूना 3 एमएल वॉश बफर (डब्ल्यूबी) (900 एमएम एनएसीएल, 20 एमएम ट्राइस पीएच 7.5, 5 एमएम ईडीटीए, 0.01% एसडीएस) तैयार करें।
      नोट: वर्षा से बचने के लिए प्रत्येक उपयोग से पहले डब्ल्यूबी को ताजा तैयार किया जाना चाहिए। हालांकि, एक सामान्य बफर (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5) अग्रिम में बनाया जा सकता है और कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि वॉश बफर की आवश्यकता न हो। उपयोग से पहले, सामान्य बफर के प्रति नमूने 3 एमएल तैयार करें और ईडीटीए को 5 एमएम की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें और एसडीएस को 0.01% की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।
    2. नमूने को उचित गति से सेंट्रीफ्यूज करें (चरण 1.1.4 देखें)। पिपेट का उपयोग करके एचबी को हटा दें, जबकि निमेटोड गोली को अबाधित छोड़ने के लिए सावधान रहें।
    3. प्रत्येक नमूने में तैयार डब्ल्यूबी का 1 एमएल जोड़ें।
    4. नमूने को उचित गति से सेंट्रीफ्यूज करें (चरण 1.1.4 देखें)। पिपेट का उपयोग करके डब्ल्यूबी को हटा दें, जबकि गोली को अबाधित छोड़ने के लिए सावधान रहें।
    5. प्रत्येक नमूने में तैयार डब्ल्यूबी का 1 एमएल जोड़ें।
    6. सूखे स्नान में 48-56 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें (या 1200 आरपीएम पर 48-56 डिग्री सेल्सियस पर थर्मल मिक्सर)। यदि सूखे स्नान में इनक्यूबेट किया जाता है, तो धीरे से हर 15-20 मिनट में ट्यूबों को उलट दें।
      नोट: सामान्य तौर पर, 48 डिग्री सेल्सियस का उपयोग मानक धोने के तापमान के रूप में किया जाता है; हालांकि, उच्च पृष्ठभूमि संकेत होने पर इस तापमान को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। धोने का तापमान अक्सर संकरण तापमान से 2 डिग्री सेल्सियस अधिक होता है। डब्ल्यूबी में इनक्यूबेशन समय को पृष्ठभूमि को कम करने के लिए 30 मिनट तक छोटा किया जा सकता है, जिसके बाद, चरण 1.7.4 और 1.7.5 को दोहराया जाना चाहिए। इसके बाद एक (बैक्टीरिया के लिए) या दो (माइक्रोस्पोरिडिया स्पोरोप्लाज्म के लिए) 30 मिनट इनक्यूबेशन 48 डिग्री सेल्सियस पर अवधि होनी चाहिए।
    7. नमूने को उचित गति से सेंट्रीफ्यूज करें (चरण 1.1.4 देखें)। पिपेट का उपयोग करके, वॉश बफर को हटा दें, जबकि गोली को अबाधित छोड़ने के लिए सावधान रहें।
    8. प्रत्येक नमूने में पीबीएस-टी के 100-500 μL जोड़ें। इस बिंदु पर, नमूने पीबीएस-टी में एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं जब तक कि प्रोटोकॉल जारी रखने के लिए तैयार न हो।
  8. नेमाटोड को माउंट करें
    1. नमूने को उचित गति से सेंट्रीफ्यूज करें (चरण 1.1.4 देखें)। नेमाटोड गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना पीबीएस-टी हटा दें।
    2. (वैकल्पिक) नमूने में DAPI (सामग्री की तालिका) के साथ एंटीफैड माउंटिंग माध्यम के 20 μL जोड़ें।
    3. 200 μL पिपेट टिप के साथ एक 20 μL पिपेटर लोड करें और बड़े नेमाटोड को पाइप करने की अनुमति देने के लिए पिपेट की नोक को काटने के लिए कैंची का उपयोग करें।
    4. कट पिपेट टिप के साथ, एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर गोली के 5-10 μL स्थानांतरित करें। 22 x 22 कवरस्लिप के साथ कवर करें। स्लाइड्स को स्टोर करने के लिए, कवरस्लिप के किनारों को नेल पॉलिश के साथ सील करें और उन्हें आगे के उपयोग के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे बॉक्स में रखें।

2. एसीटोन निर्धारण के साथ मछली धुंधला होना

  1. चरण 1.1 में वर्णित के रूप में संबंधित रोगाणुओं के साथ नेमाटोड तैयार करें।
  2. चरण 1.2 में वर्णित बाहरी संदूषण को खत्म करने के लिए नेमाटोड धोएं।
  3. एसीटोन के साथ नेमाटोड को ठीक करें
    1. गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरने वाला निकालें और नमूने में 1 एमएल लैब-ग्रेड एसीटोन जोड़ें।
      चेतावनी: एसीटोन एक अत्यधिक ज्वलनशील तरल और वाष्प है। यद्यपि इसे नेल पॉलिश रिमूवर के रूप में काउंटर पर खरीदा जा सकता है, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि एसीटोन गंभीर आंखों में जलन का कारण बनता है, और उनींदापन या चक्कर आना का कारण बन सकता है।
    2. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए नेमाटोड युक्त या संक्रमित माइक्रोब से संक्रमित नमूनों को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन बाद, नमूने एसीटोन में 2 सप्ताह तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं जब तक कि प्रोटोकॉल जारी रखने के लिए तैयार न हो।
      ध्यान दें: जीएफपी (या इसके एलील उत्परिवर्तित रूपों) को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक सी एलिगेंस उपभेदों के साथ इस प्रोटोकॉल का उपयोग न करें यदि यह प्रतिदीप्ति को बनाए रखने के लिए वांछित है, क्योंकि एसीटोन इस संकेत को नष्ट कर देता है।
  4. एसीटोन निकालें
    1. नमूनों को उचित गति से माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में स्पिन करें (चरण 1.1.4 देखें)। पिपेट के साथ, गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
      सावधानी: सतह पर तैरने वाले में एसीटोन होता है। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और कम से कम पहले दो धोने को फ्यूम हुड में जहरीले कचरे के रूप में धो लें।
    2. माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में नमूने में पीबीएस-टी के 0.5 एमएल जोड़ें।
    3. PBS-T के साथ चरण 2.4.1 और 2.4.2 2-4x का पालन करें और दोहराएँ।
      नोट: अधिक धोने का प्रदर्शन पृष्ठभूमि संकेत को कम करने में मदद करेगा। कुल मिलाकर चार वॉश करने की सिफारिश की जाती है।
    4. अंतिम धोने के बाद, नमूनों को नीचे घुमाएं और सतह पर तैरने वाले को हटा दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि गोली अबाधित है।
  5. संकरण बफर (एचबी) तैयार करें और चरण 1.5 में वर्णित नेमाटोड को धो लें।
  6. चरण 1.6 में वर्णित के रूप में वांछित लक्ष्य अनुक्रम के लिए फिश जांच को हाइब्रिड करें।
  7. मछली की जांच निकालें और नेमाटोड धो लें
    1. प्रति नमूना 1.1 एमएल वॉश बफर (डब्ल्यूबी) (900 एमएम एनएसीएल, 20 एमएम ट्राइस पीएच 7.5, 5 एमएम ईडीटीए, 0.01% एसडीएस) तैयार करें।
      नोट: वर्षा से बचने के लिए प्रत्येक उपयोग से पहले डब्ल्यूबी को ताजा तैयार किया जाना चाहिए। हालांकि, एक सामान्य बफर (900 एमएम एनएसीएल, 20 एमएम ट्राइस पीएच 7.5) अग्रिम में बनाया जा सकता है और कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि वॉश बफर की आवश्यकता न हो। उपयोग से पहले, सामान्य बफर के प्रति नमूने 1.1 एमएल तैयार करें और ईडीटीए को 5 एमएम की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें और एसडीएस को 0.01% की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।
    2. नमूनों को उचित गति से सेंट्रीफ्यूज करें (1.1.4 देखें)। पिपेट का उपयोग करके एचबी को हटा दें, जबकि निमेटोड गोली को अबाधित छोड़ने के लिए सावधान रहें।
    3. प्रत्येक नमूने में तैयार WB का 100 μL जोड़ें।
    4. नमूनों को उचित गति से सेंट्रीफ्यूज करें (1.1.4 देखें)। पिपेट का उपयोग करके डब्ल्यूबी को हटा दें, जबकि गोली को अबाधित छोड़ने के लिए सावधान रहें।
    5. प्रत्येक नमूने में तैयार डब्ल्यूबी का 1 एमएल जोड़ें।
    6. सूखे स्नान में 48-56 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें (या 1,200 आरपीएम पर 48-56 डिग्री सेल्सियस पर थर्मल मिक्सर)। यदि सूखे स्नान में इनक्यूबेट किया जाता है, तो धीरे से हर 15-20 मिनट में ट्यूबों को उलट दें।
      नोट: सामान्य तौर पर, 48 डिग्री सेल्सियस का उपयोग मानक धोने के तापमान के रूप में किया जाता है; हालांकि, उच्च पृष्ठभूमि संकेत होने पर इस तापमान को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। धोने का तापमान अक्सर संकरण तापमान से 2 डिग्री सेल्सियस अधिक होता है।
    7. नमूने को उचित गति से सेंट्रीफ्यूज करें (चरण 1.1.4 देखें)। पिपेट का उपयोग करके, वॉश बफर को हटा दें, जबकि गोली को अबाधित छोड़ने के लिए सावधान रहें।
    8. प्रत्येक नमूने में पीबीएस-टी के 100-500 μL जोड़ें। इस बिंदु पर, नमूने पीबीएस-टी में एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं जब तक कि प्रोटोकॉल जारी रखने के लिए तैयार न हो।
  8. चरण 1.8 में वर्णित निमेटोड को माउंट करें।

Representative Results

माइक्रोबायोम बैक्टीरिया का विश्लेषण करने के लिए, जंगली-पृथक जानवरों पर बैक्टीरियल 16 एस के लिए विशिष्ट और सार्वभौमिक मछली जांच का उपयोग किया गया था। जंगली केनोरहाब्डिस ट्रॉपिकलिस स्ट्रेन (जेयू 1848) को फ्रांसीसी गुयाना में एक छोटी नदी के पास नौरागेस जंगल से ताड़ के पेड़के फलों के सड़ने से नमूना लिया गया था। विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोप के तहत, इस नेमाटोड तनाव को एक जीवाणु के साथ उपनिवेशित पाया गया था जो आंतों के उपकला (चित्रा 2 ए) का दिशात्मक रूप से पालन करता प्रतीत होता है। जेयू 1848 को तब अन्य माइक्रोबियल दूषित पदार्थों को खत्म करने और वांछित पालन करने वाले जीवाणु23 के लिए समृद्ध करने के लिए चुनिंदा रूप से साफ किया गया था। सार्वभौमिक पीसीआर विधि का उपयोग करते हुए, जीवाणु को अल्फाप्रोटियोबैक्टीरिया वर्ग में एक नई प्रजाति के रूप में पहचाना गया था। कैल फ्लूर रेड 610 के साथ लेबल की गई एक मछली जांच को विशेष रूप से इस जीवाणु के 16 एस आरआरएनए अनुक्रम के लिए डिज़ाइन किया गया था ताकि सी ट्रॉपिकलिस (चित्रा 2 बी) के भीतर उपनिवेशीकरण के फ्लोरोसेंट विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति मिल सके। बैक्टीरिया की कई प्रजातियों (ईयूबी 338) को बांधने में सक्षम एक सार्वभौमिक 16 एस आरआरएनए फिश जांच को 6-कार्बोक्सीफ्लोरेसिन (एफएएम) के साथ लेबल किया गया था और इस नमूने में भी जोड़ा गया था। हरे और लाल फ्लोरोसेंट सिग्नल पूरी तरह से ओवरलैप होते हैं, यह सुझाव देते हुए कि आंतों को उपनिवेशित करने वाले अधिकांश बैक्टीरिया अल्फाप्रोटियोबैक्टीरिया जीवाणु का पालन कर रहे हैं। इन जानवरों को धुंधला होने से पहले पीएफए में ठीक किया गया था।

ज्ञात पहचान के इंट्रासेल्युलर रोगजनकों के साथ प्रयोगशाला में प्रयोगात्मक संक्रमण का विश्लेषण करने के लिए, ऑर्से वायरस और माइक्रोस्पोरिडियन-विशिष्ट फिश जांच का उपयोग जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि वाले सी एलिगेंस पर किया गया था। ओरसे वायरस नोडाविरिडे परिवार से एक सकारात्मक-स्ट्रैंड आरएनए वायरस है, और सी एलिगेंस में पाया जाने वाला एकमात्र प्राकृतिक वायरल रोगज़नक़ है। ओरसे वायरस के द्विपक्षीय आरएनए जीनोम में आरएनए 1 और आरएनए 2 खंड होते हैं, और इन दोनों खंडों को लक्षित करने वाली फिश जांच विकसित की गई है (चित्रा 3 ए, बी) 9,18। आंत में, वायरल आरएनए को आरआईजी-आई होमोलॉग डीआरएच -124 द्वारा महसूस किया जाता है, जो इंट्रासेल्युलर पैथोजन रिस्पांस (आईपीआर) 25,26,27 नामक ट्रांसक्रिप्शनल रक्षा कार्यक्रम के सक्रियण के लिए आवश्यक है। एंटीवायरल आईपीआर जीन का प्रतिलेखन कम से कम आंशिक रूप से ज़िप -1 प्रतिलेखन कारक21 द्वारा नियंत्रित होता है। यहां, ज़िप -1 की अभिव्यक्ति:: जीएफपी कोशिकाओं के आंतों के नाभिक में स्थानीयकृत देखा जाता है जो साइटोप्लाज्म (चित्रा 3 ए) 21 में सकारात्मक ओरसे वायरस फिश धुंधला दिखाते हैं। ओरसे-विशिष्ट मछली से सना कई जानवरों को आसान मात्रा के लिए इस संकेत की ताकत को इंगित करने के लिए दिखाया गया है (चित्रा 3 बी)। चित्रा 3 ए, बी में दिखाए गए जानवरों को पीएफए में तय किया गया था।

नेमाटोसिडा पेरिसी नामक माइक्रोस्पोरिडियन परजीवी, जिसका अर्थ पेरिस से नेमाटोड-किलर है, आंत का एक बाध्यकारी इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़ है। पेरिसी के 18 एस आरआरएनए को लेबल करने वाले कई फिश प्रोब्स का उपयोग किया गया है, जिसमें फ्लोरोसेंटली टैग किए गए माइक्रोए और माइक्रोबी जांच शामिल हैं। माइक्रोबी फिश से सना कई जानवरों को आसान मात्रा के लिए इस संकेत की ताकत को इंगित करने के लिए दिखाया गया है (चित्रा 3 सी)। इसके अतिरिक्त, सी एलिगेंस अन्य निकटता से संबंधित माइक्रोस्पोरिडिया से संक्रमित है। एन पेरिसी और संबंधित एन ऑसुबेली के साथ एन 2 के सह-संक्रमण को इस फिश प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्रजाति-विशिष्ट फिश जांच डिजाइन करके अलग किया जा सकता है जो 18 एस आरआरएनए (चित्रा 3 डी) 28 पर एक अलग क्षेत्र को बांधने के लिए एक दूसरे के खिलाफ प्रतिस्पर्धा करते हैं। इस उदाहरण में, एन पेरिसी फिश प्रोब में एन पेरिसी 18 एस आरआरएनए के लिए सही बेस-पेयरिंग है, लेकिन एन ऑसुबेली 18 एस आरआरएनए के लिए 7 बीपी बेमेल है। एन ऑसुबेली जांच के लिए विपरीत सच है। इस प्रकार, प्रत्येक प्रजाति-विशिष्ट मछली जांच गैर-आत्मीय प्रजातियों पर आत्मीय प्रजातियों 18 एस को बांधने के लिए प्रतिस्पर्धा करेगी। इसके अतिरिक्त, नाभिक को दागने के लिए DAPI का उपयोग पूरे जानवर के संदर्भ में संक्रमण के बेहतर स्थानीयकरण की अनुमति देता है, विशेष रूप से आंत के लिए जिसमें बड़े, आसानी से पहचाने जाने योग्य नाभिक होते हैं। चित्रा 3 सी, डी में ऐसे जानवर शामिल हैं जो पीएफए में तय किए गए थे। पेरिसी के साथ बाद में संक्रमण के परिणामस्वरूप बीजाणुओं में मेरोन्ट का विकास होता है। पेरिसी बीजाणुओं की कल्पना करने के लिए, जानवरों को एसीटोन में तय किया जाना चाहिए क्योंकि यह पीएफए (चित्रा 3 ई, एफ) 8 की तुलना में बीजाणु की दीवार में बेहतर प्रवेश करता है। परिणामस्वरूप मछली धुंधला होना छोटे और बड़े रॉड के आकार की संरचनाओं को प्रदर्शित करता है, जो संभवतः एन पेरिसी बीजाणुओं के अनुरूप हैं, जो लाल रंग में एन पेरिसी-विशिष्ट जांच से सना हुआ है।

Figure 1
चित्रा 1: फिश प्रोटोकॉल का दृश्य प्रतिनिधित्व। Biorender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: जंगली सी ट्रॉपिकलिस जेयू 1848 स्ट्रेन का मछली धुंधला होना आंतों में बैक्टीरिया का पालन करने के साथ उपनिवेशित है। (ए) नोमार्स्की छवि में हजारों पतले बेसिली बैक्टीरिया (बीएसी) को जेयू 1848 की आंत (इन) से दिशात्मक रूप से बांधा गया है, जिससे लुमेन (लू) के भीतर बाल जैसा फेनोटाइप बनता है। यह आंकड़ा पैनल मॉर्गन, ई एट अल (2021)23 से अनुकूलित है। (ख) पीएफए में निर्धारित जेयू1848 की मछलियों का धुंधलापन, एक लाल लेबल वाली जांच (b002_16S_A-सीएफ610) का उपयोग करके, जिसे बैक्टीरिया (ऊपर) के 16 एस आरआरएनए अनुक्रम और बैक्टीरिया (नीचे) के 16 एस को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किए गए हरे लेबल वाले सार्वभौमिक मछली जांच (ईयूबी 338-एफएएम) को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। मेजबान नाभिक का DAPI धुंधलापन नीले रंग में दिखाया गया है। जांच अनुक्रमों के लिए तालिका 1 देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: इंट्रासेल्युलर रोगजनकों से संक्रमित सी एलिगेंस की मछली धुंधला होना। (ए, बी) सी एलिगेंस की मछली धुंधला होना जो ज़िप -1 को व्यक्त करता है:: जीएफपी और ओरसे वायरस से संक्रमित, जिसे जीएफपी सिग्नल को संरक्षित करने के लिए धुंधला करने से पहले पीएफए के साथ तय किया गया था। रोगज़नक़ धुंधला करने के लिए ओरसे 1 लाल और ओरसे 2 लाल जांच का उपयोग किया गया था। (ए) समग्र छवि में विलय लाल और हरे फ्लोरोसेंट चैनल होते हैं। परमाणु ज़िप -1: जीएफपी अभिव्यक्ति ओरसे वायरस संक्रमण पर प्रेरित होती है और इसे हरे रंग में दिखाया जाता है। आंत के कणिकाओं से ऑटोफ्लोरेसेंस को पीले रंग में दिखाया जाता है और पीले तीर के साथ इंगित किया जाता है। बिंदीदार रेखाएं नेमाटोड शरीर को रेखांकित करती हैं। स्केल बार = 25 μm. (B) मिश्रित छवि में विलय लाल फ्लोरोसेंट और डीआईसी चैनल होते हैं। स्केल बार = 200 μm. (C,D) जंगली प्रकार के C. एलिगेंस का मछली धुंधला होना जो PFA में तय किए गए माइक्रोस्पोरिडिया से संक्रमित थे। (ग) जंगली प्रकार के सी एलिगेंस की मछली का धुंधला होना जो एन पेरिसी से संक्रमित है और पीएफए में स्थिर है। माइक्रोबी-सीएफ 610 जांच का उपयोग रोगज़नक़ धुंधला करने के लिए किया गया था। समग्र छवि में विलय किए गए लाल फ्लोरोसेंट और डीआईसी चैनल शामिल हैं। स्केल बार = 100 μm. (D) आंत में N. पेरिसी और N. Ausubeli के साथ सह-संक्रमित जंगली प्रकार C. एलिगेंस की मछली धुंधला होना। दो रोगजनकों को विशिष्ट फिश जांच की एक जोड़ी का उपयोग करके सह-दाग दिया गया था जो 18 एस आरआरएनए के एक ही क्षेत्र में बंधन के लिए प्रतिस्पर्धा करते हैं। एन पेरिसी को माइक्रोएफ-सीएफ 610 (लाल) का उपयोग करके दाग दिया गया था और एन ऑसुबेली को माइक्रोएसपी 1 ए-एफएएम (हरे) का उपयोग करके दाग दिया गया था। मेजबान नाभिक का DAPI धुंधलापन नीले रंग में देखा जाता है। स्केल बार = 25 μm. (E) एसीटोन-फिक्स्ड वाइल्ड-टाइप सी. एलिगेंस के साथ मछली धुंधला होना जो एन. पेरिसी बीजाणुओं से संक्रमित है। माइक्रोए-सीएफ 610 (लाल) का उपयोग धुंधला (लाल) के लिए किया गया था। स्केल बार = 15 μm. (F) नोमार्स्की छवि (E) में देखे गए N. पेरिसी बीजाणुओं को दर्शाती है। स्केल बार = 15 μm। (ई) और (एफ) में, छोटे और बड़े रॉड के आकार की संरचनाओं को क्रमशः छोटे और बड़े तीरों के साथ लेबल किया जाता है, जो एन पेरिस बीजाणुओं के अनुरूप होते हैं। जांच अनुक्रमों के लिए तालिका 1 देखें। (ए) में दिखाई गई छवि को लाज़ेटिक, वी एट अल (2022)21 से अनुकूलित किया गया है। (बी) और (सी) में दिखाए गए चित्र रेड्डी, के. सी. एट अल. (2019)26 से अनुकूलित हैं। (ई) और (एफ) में दिखाए गए चित्रों को ट्रोमेल, ई. आर. एट अल. (2008)8 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

जांच का नाम जांच विशिष्टता प्रोब फ्लोरोफोरे जांच अनुक्रम
EUB338-FAM बैक्टीरियल 16 एस (सार्वभौमिक) 5'6-फ्लोरेसिन (एफएएम) GCTGCCCCCCGTAGGAGT
b002_16S_A-CF610 अल्फाप्रोटियोबैक्टीरिया 16 एस कैल फ्लोर रेड 610 (सीएफ 610) TGTACCCCTAACGTTC
Orsay1 लाल Orsay वायरस RNA1 कैल फ्लोर रेड 610 (सीएफ 610) GACATATGTGATGCCGAC
Orsay2 Red Orsay वायरस RNA2 कैल फ्लोर रेड 610 (सीएफ 610) GTAGTGTCATTGTAGGCAGC
MicroA-CF610 Nematocida parisi 18S कैल फ्लोर रेड 610 (सीएफ 610) CTCTGTCCATCCTCGGCAA
MicroB-CF610 Nematocida parisi 18S कैल फ्लोर रेड 610 (सीएफ 610) CTCTCGGCACTCCTTCTG
MicroF-CF610 Nematocida parisi 18S कैल फ्लोर रेड 610 (सीएफ 610) AGACAAATCAGTCCACGAATT
MicroSp1A-FAM Nematocida ausubeli 18S 5'6-फ्लोरेसिन (एफएएम) CAGGTCACCACCGTGCT

तालिका 1: मछली जांच अनुक्रमों की सूची। सभी फिश प्रोब्स को व्यावसायिक रूप से 5'छोर से जुड़े फ्लोरोफोरे के साथ खरीदा गया था (कस्टम ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण के माध्यम से ; सामग्री की तालिका देखें) और ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को रिवर्स-फेज एचपीएलसी द्वारा शुद्ध किया गया था।

Discussion

एलिगेंस स्वाभाविक रूप से विभिन्न प्रकार के रोगाणुओं से जुड़े होते हैं। शोधकर्ता इन रोगाणुओं का पता लगाने और पहचान करने के साथ-साथ एक पूरे जानवर के संदर्भ में उनके स्थानीयकरण में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए आरएनए फिश का उपयोग कर सकते हैं। वांछनीय या दिलचस्प फेनोटाइप वाले रोगाणुओं को इस विधि के माध्यम से पहचाना जा सकता है और फिर आगे के लक्षण वर्णन और अनुक्रमण के लिए अलग किया जा सकता है। जंगली सी एलिगेंस से कई जीवाणु आइसोलेट्स की बहुतायत को आरएनए फिश29 के माध्यम से भी निर्धारित किया जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, उनके मेजबानों के अंदर ज्ञात सूक्ष्मजीवों का निरीक्षण करना और उनकी बातचीत के बारे में अधिक जानना भी संभव है। महत्वपूर्ण रूप से, ऑर्से वायरस और माइक्रोस्पोरिडिया परजीवी हैं और मेजबान से स्वतंत्र रूप से सुसंस्कृत नहीं किए जा सकते हैं, इसलिए फिश मानक विज़ुअलाइज़ेशन टूल है। कॉलोनाइजेशन या संक्रमण को आरएनए फिश के माध्यम से वांछित संवर्धन योग्य बैक्टीरिया के साथ बीजित प्लेटों पर उगाए गए नेमाटोड का उपयोग करके भी निर्धारित किया जा सकता है। एलिगेंस आंत में सूक्ष्मजीवों को धुंधला करने के अलावा, इस प्रोटोकॉल का उपयोग सी ट्रॉपिकलिस या ओशियस टिपुला19,23 जैसे अन्य नेमाटोड उपभेदों के लिए किया जा सकता है।

फिश प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ यह है कि यह सी एलिगेंस से जुड़े रोगाणुओं को दागने के लिए एक सरल, त्वरित और मजबूत विधि प्रदान करता है। फिश स्टेनिंग से उत्पादित छवियों में एक उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है, जो फिश जांच का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है जो नमूने के भीतर एसएसयू के प्रचुर मात्रा में आरएनए को लक्षित करता है। चूंकि आरडीएनए की तुलना में आम तौर पर आरआरएनए के 30 x या उच्च स्तर होते हैं, इसलिए आरआरएनए को लक्षित करने वाली जांच के साथ फिश स्टेनिंग से अधिकांश सिग्नल आरडीएनए30 के बजाय आरआरएनए के कारण होते हैं। इसके अलावा, आरएनए मछली पूरे जानवर के संदर्भ में संक्रमण या उपनिवेश को देखना संभव बनाती है। इस विज़ुअलाइज़ेशन को डीएपीआई के साथ सह-धुंधला मेजबान नाभिक के माध्यम से और / या नमूने के भीतर संक्रमण या उपनिवेशीकरण के स्थानीयकरण को बेहतर ढंग से उजागर करने के लिए सी एलिगेंस के फ्लोरोसेंट-चिह्नित उपभेदों का उपयोग करके सुविधाजनक बनाया गया है। उदाहरण के लिए, माइक्रोस्पोरिडियन-विशिष्ट मछली का उपयोग विभिन्न ऊतकों में जीएफपी अभिव्यक्ति के साथ सी एलिगेंस उपभेदों के एक पैनल का उपयोग करके नेमाटोसिडा डिस्प्लोडेर के ऊतक ट्रोपिज्म को निर्धारित करने के लिएकिया गया था। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल उन परिवर्तनों के लिए उत्तरदायी है जो शोधकर्ताओं को उनकी विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए उपयुक्त आदर्श स्थितियों को निर्धारित करने की अनुमति देते हैं (उदाहरण के लिए, निर्धारण अवधि को समायोजित करना, संकरण तापमान में वृद्धि करना)।

फिश प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम नमूने को ठीक करना है। फिक्सेटिव को जोड़ने के बाद इनक्यूबेशन अवधि एजेंट को नमूने को स्थिर करने के लिए समय की अनुमति देने के लिए आवश्यक है। समय के साथ पीएफए द्वारा प्रोटीन क्षरण के कारण ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन युक्त नमूनों के लिए लंबे समय तक इनक्यूबेशन समय आदर्श नहीं हैं। जीएफपी युक्त नमूनों के लिए, जीएफपी सिग्नल को बनाए रखते हुए, परमेबिलाइजेशन की अनुमति देने के लिए इष्टतम निर्धारण समय निर्धारित करना अनिवार्य है।

मछली का उपयोग सी एलिगेंस में बैक्टीरिया, वायरस या माइक्रोस्पोरिडिया के लिए दाग लगाने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, मछली के लिए उपयोग किया जाने वाला सबसे अच्छा प्रकार का फिक्सेटिव एजेंट नमूना और डाउनस्ट्रीम आवश्यकताओं पर निर्भर करता है। यह प्रोटोकॉल बैक्टीरिया और वायरस को दागने के लिए प्राथमिक फिक्सेटिव एजेंट के रूप में एक पीएफए समाधान प्रस्तुत करता है। हालांकि, पीएफए माइक्रोस्पोरिडियन बीजाणुओं के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए पर्याप्त नहीं है क्योंकि यह बीजाणु की दीवार में प्रवेश नहीं कर सकता है। बीजाणुओं के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, एसीटोन का उपयोग इसके बजाय किया जाना चाहिए। हालांकि, पीएफए निर्धारण माइक्रोस्पोरिडिया के अन्य जीवन चरणों के फिश लेबलिंग के लिए कुशल है, जिसमें स्पोरोप्लाज्म, मेरोन्ट और स्पोरोन्ट शामिल हैं। एसीटोन निर्धारण और पीएफए निर्धारण के बीच अन्य प्रमुख अंतर देखे जाते हैं; एसीटोन अधिक सुविधाजनक है क्योंकि नमूने धोने की आवश्यकता के बिना, जोड़ने के बाद फ्रीजर में जल्दी से संग्रहीत किए जा सकते हैं। हालांकि, एसीटोन ट्रांसजेनिक मेजबान में किसी भी मौजूदा जीएफपी को जल्दी से मार देता है। पीएफए पसंदीदा फिक्सेटिव है यदि मेजबान में कुछ शारीरिक संरचनाओं को संरक्षित करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि एसीटोन-फिक्स्ड जानवर अधिक अवक्रमित होते हैं, जिससे कुछ ऊतकों की पहचान अधिक कठिन हो जाती है। क्योंकि नमूने तय किए गए हैं, यह फिश प्रोटोकॉल विवो में मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन की लाइव इमेजिंग की अनुमति नहीं देता है। हालांकि, पल्स-चेज़ संक्रमण समय पाठ्यक्रम के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर नमूनों के फिश स्टेनिंग से माइक्रोबियल संक्रमण 19,20,31 की कुछ गतिशीलता देखने की अनुमति मिल सकती है।

प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम संकरण से पहले और बाद में नमूनों की पूरी तरह से धुलाई है। संकरण से पहले, माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में कीड़े एकत्र करते समय, एनजीएम प्लेटों से अतिरिक्त बैक्टीरिया, या अन्य रोगाणुओं को कृमि के नमूने के साथ ले जाया जा सकता है। पीबीएस-टी के साथ तीन धोने मानक हैं; हालांकि, बाहरी सूक्ष्मजीवों को पर्याप्त रूप से खत्म करने के लिए अधिक धोने की आवश्यकता हो सकती है, खासकर जब भारी दूषित, जंगली-पृथक सी एलिगेंस का उपयोग किया जाता है। मछली के बाद माउंटेड नमूने देखते समय, कुछ अवशिष्ट मछली जांच हो सकती है जो नमूने की पृष्ठभूमि में बड़ी मात्रा में संकेत पैदा करती है। अतिरिक्त और गैर-विशेष रूप से बाध्य जांच को हटाने के लिए धोने का तापमान और वॉश की संख्या महत्वपूर्ण है। पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करने के लिए, एक घंटे के लिए 1 एमएल डब्ल्यूबी के साथ एक धोने के बजाय, हर 30 मिनट में 1 एमएल डब्ल्यूबी के साथ दो या तीन वॉश करना संभव है। विभिन्न मछली जांच को अलग-अलग धोने के तापमान की आवश्यकता हो सकती है। आमतौर पर, धोने का तापमान संकरण तापमान से 2 डिग्री सेल्सियस ऊपर होता है, लेकिन बहुत अधिक पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (उच्च शोर) होने पर इसे बढ़ाया जा सकता है।

फिश प्रोटोकॉल प्रजातियों-विशिष्ट माइक्रोबियल आरएनए को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किए गए फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करता है, लेकिन फिश जांच को अन्य उच्च-प्रतिलिपि प्रतिलेख के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। अन्य मछली जांच में अलग-अलग पिघलने का तापमान हो सकता है, इसलिए इनक्यूबेशन चरणों को वर्णित की तुलना में उच्च या निम्न तापमान पर करने की आवश्यकता हो सकती है। मछली धुंधला मेजबान के भीतर माइक्रोबियल उपनिवेश या संक्रमण के स्थानिक वितरण की पहचान कर सकता है, जिससे मेजबान-माइक्रोब और माइक्रोब-माइक्रोब इंटरैक्शन के लक्षण वर्णन की अनुमति मिलती है। एक सीमा यह है कि केवल कुछ पारंपरिक फ्लोरोफोरे का उपयोग एक साथ किया जा सकता है, जो विभिन्न सूक्ष्मजीवों की संख्या को कम करता है जिन्हें एक ही समय में मछली के माध्यम से पता लगाया जा सकता है। यह सी एलिगेंस में जटिल माइक्रोबायोम अध्ययन के लिए इसके उपयोग को सीमित करता है। हालांकि, मल्टीकलर आरआरएनए-लक्षित मछली गैर-कैननिकल फ्लोरोफोरे के साथ लेबल की गई जांच का उपयोग करती है जो अलग-अलग माइक्रोबियल समूह लेबल15 की संख्या बढ़ा सकती है। एक और सीमा यह है कि निकटता से संबंधित प्रजातियों, विशेष रूप से बैक्टीरिया के बीच अंतर करना मुश्किल है, जिनमें एसएसयू अनुक्रम हैं जो अत्यधिक समान हैं। हालांकि, माइक्रोस्पोरिडिया प्रजातियों के बीच चरम अनुक्रम विचलन इस प्रोटोकॉल (चित्रा 3) 32,33 के साथ उनके भेदभाव को सुविधाजनक बनाने में मदद करता है।

कुल मिलाकर, यह फिश प्रोटोकॉल सी एलिगेंस के भीतर सूक्ष्मजीवों का पता लगाने के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है। यह शोधकर्ताओं को एक बरकरार जानवर के संदर्भ में उपनिवेशऔर संक्रमण का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक पारदर्शी और आनुवंशिक रूप से वापस लेने योग्य मॉडल प्रणाली का उपयोग करने की अनुमति देता है, साथ ही मेजबान के भीतर अद्वितीय माइक्रोबियल व्यवहार या आकृति विज्ञान की पहचान करता है। समीक्षा34 के दौरान इस पांडुलिपि का एक प्रीप्रिंट संस्करण पोस्ट किया गया था।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

मैरी-ऐनी फेलिक्स को हमें जंगली नेमाटोड उपभेदों के साथ प्रदान करने के लिए धन्यवाद। इस काम को कैरियर ग्रांट 2143718 के तहत एनएसएफ और कैलिफोर्निया स्टेट यूनिवर्सिटी द्वारा आरजेएल, एनआईएच को आर01 एजी052622 और आर01 जीएम 114139 के तहत ईआरटी को सीएसयूपर्ब न्यू इन्वेस्टिगेटर अवार्ड के तहत और वीएल के लिए अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS Invitrogen AM9822
Acetone Fisher Scientific A-11-1
Antifade mounting serum with DAPI (Vectashield) Vectalab NC9524612
EDTA Fisher Scientific S311-500
FISH probes (see Table 1) LGC Biosearch Technologies FISH probes were commercially purchased via custom oligonucleotide synthesis
KCl Fisher Scientific P217
KH2PO4 Fisher Scientific P-286
Na2HPO4 Fisher Scientific S375-500
NaCl Fisher Scientific S-671
NH4Cl Fisher Scientific A-661
Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 50-980-487 CAUTION: PFA is a carcinogen. Handle appropriately
Thermal mixer Eppendorf 5384000020
Tris base Fisher Scientific BP152
Triton X-100 Fisher Scientific BP-151
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 185
<em>केनोरहाब्डिस एलिगेंस</em> आंतों में माइक्रोबियल औपनिवेशीकरण और संक्रमण की कल्पना करने के लिए <em>सीटू</em> संकरण (फिश) में आरएनए फ्लोरेसेंस
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Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines. J. Vis. Exp. (185), e63980, doi:10.3791/63980 (2022).

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