In vitro Dosage de la destruction des globules rouges infectés par le plasmodium par des lymphocytes cytotoxiques

Summary

Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour aider à élucider les mécanismes de l’immunité cellulaire à Plasmodium pendant le stade sanguin de l’infection. Il s’agit d’un test in vitro qui mesure la destruction des globules rouges infectés par les lymphocytes cytotoxiques.

Abstract

Le paludisme est un problème majeur de santé publique, présentant plus de 200 millions de cas par an dans le monde. Malgré des années d’efforts scientifiques, l’immunité protectrice contre le paludisme est encore mal comprise, principalement en raison des limites méthodologiques de la culture à long terme de Plasmodium, en particulier pour Plasmodium vivax. La plupart des études se sont concentrées sur la protection immunitaire adaptative contre le paludisme par des anticorps, qui jouent un rôle clé dans la lutte contre le paludisme. Cependant, la protection stérile induite par les vaccins atténués contre les sporozoïtes de Plasmodium est liée à la réponse cellulaire, principalement aux lymphocytes T cytotoxiques, tels que les lymphocytes T CD8⁺ et gamma delta (γδ T). Par conséquent, de nouvelles méthodologies doivent être développées pour mieux comprendre les fonctions de la réponse immunitaire cellulaire et ainsi soutenir la thérapie future et le développement de vaccins. Pour trouver une nouvelle stratégie pour analyser cette immunité à médiation cellulaire contre l’infection au stade sanguin de Plasmodium, notre groupe a établi un test in vitro qui mesure la destruction des globules rouges infectés (iRBC) par les lymphocytes cytotoxiques. Ce test peut être utilisé pour étudier les mécanismes de réponse immunitaire cellulaire contre différents Plasmodium spp. au stade sanguin. Les cellules immunitaires cytotoxiques innées et adaptatives peuvent éliminer directement les iRBC et le parasite intracellulaire dans un mécanisme effecteur:cible. Les iRBC cibles sont marqués pour évaluer la viabilité cellulaire et cocultivés avec des cellules effectrices (cellules CD8⁺ T, γδ T, NK, etc.). Le pourcentage de lyse est calculé en fonction des conditions testées, par rapport à un contrôle de lyse spontanée dans un test basé sur la cytométrie de flux. En fin de compte, cette méthodologie de test de destruction est une avancée majeure dans la compréhension de l’immunité à médiation cellulaire contre le paludisme au stade sanguin, aidant à découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles et à accélérer le développement de vaccins contre le paludisme.

Introduction

Le paludisme reste une crise sanitaire mondiale, avec plus de 240 millions de cas et 627 000 décès liés au paludisme signalés en 2020¹. Il existe actuellement cinq espèces parasitaires qui peuvent causer le paludisme chez l’homme, dont Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax sont les deux espèces les plus répandues. Au cours de l’infection à Plasmodium , le foie ou le stade pré-érythrocytaire est asymptomatique et les symptômes ne surviennent que pendant le cycle asexué du parasite au stade érythrocytaire. À ce stade de l’infection, des milliers de mérozoïtes dérivés du stade hépatique sont libérés dans la circulation sanguine et infectent les globules rouges (GR). Dans le globule rouge, les parasites se différencient en trophozoïtes et schizontes par schizogone, jusqu’à ce que les schizontes rompent l’érythrocyte, libérant des mérozoïtes nouvellement formés, répétant ce cycle sanguin. Des cycles répétés d’invasion, de réplication et de libération de mérozoïte entraînent une croissance exponentielle de la population parasitaire et déclenchent finalement des symptômes de la maladie².

Un défi important dans l’étude de la réponse immunitaire au paludisme est que le Plasmodium spp. qui infecte les humains n’infecte pas les modèles animaux de laboratoire. Ainsi, les échantillons de patients infectés par Plasmodium doivent être prélevés frais et immédiatement traités et analysés. Cependant, dans les zones d’endémie palustre, les ressources pour accéder aux mécanismes immunologiques et moléculaires sont limitées. En raison de ces limitations, les rongeurs sont largement utilisés comme modèles expérimentaux pour étudier la réponse immunitaire contre l’infection à Plasmodium. Alors que P. berghei et P. chabaudi sont souvent utilisés comme substituts pour l’infection à P. falciparum, la souche non létale de P. yoelii 17XNL a également de nombreuses caractéristiques en commun avec P. vivax, telles que l’infection restreinte aux réticulocytes ^3,4. Le développement des tests in vitro de Plasmodium, qui peuvent être utilisés pour des échantillons dérivés de modèles humains ou animaux, est précieux pour mieux comprendre la pathogenèse du paludisme et comparer la réponse immunologique provoquée par différentes espèces du parasite.

L’immunité antipaludique protectrice n’est pas complètement comprise, ni au stade pré-érythrocytaire, ni au stade sanguin. On sait que l’exposition à des infections répétées entraîne une immunité acquise partielle, mais l’immunité stérile est rarement développée⁵. Pendant des décennies, l’immunité protectrice anti-Plasmodium a été principalement associée à l’induction d’anticorps neutralisants ou opsonisants qui empêchent l’invasion parasitaire des cellules hôtes ou conduisent à la phagocytose par les cellules présentatrices d’antigènes, respectivement⁶. En conséquence, la plupart des efforts déployés jusqu’à présent pour produire des vaccins antipaludiques ont reposé sur l’induction d’anticorps protecteurs et durables ^7,8. Cependant, la protection stérile induite par la vaccination avec un sporozoïte atténué est directement corrélée à l’activation et à l’expansion des lymphocytes T cytotoxiques ^8,9.

Récemment, certaines études portant sur des échantillons de patients fraîchement isolés et des cultures in vitro ont démontré que les cellules immunitaires cytotoxiques innées ou adaptatives comme les cellules CD8⁺ T 10, γδ T¹¹ et NK¹² peuvent éliminer directement les globules rouges infectés par Plasmodium et son parasite intracellulaire de manière effecteur/cible. Ces découvertes fondamentales ont défini un mécanisme effecteur immunitaire entièrement nouveau dans le contexte du paludisme. Pour disséquer cette nouvelle immunité antipaludique, il est essentiel d’explorer les mécanismes effecteurs cytotoxiques des cellules tueuses contre les globules rouges infectés (iRBC) dans l’infection naturelle ou la vaccination.

Nous présentons ici un test in vitro qui mesure l’activité cytotoxique des lymphocytes contre le paludisme au stade sanguin. Ce test peut alors aider à élucider les mécanismes de la réponse immunitaire cellulaire contre le stade érythrocytaire Plasmodium . Les cellules cibles, les iRBC, sont marquées avec de l’ester de carboxyfluorescéine succinimidyl (CFSE) pour évaluer la viabilité cellulaire, puis sont cocultivées avec des cellules effectrices comme les lymphocytes cytotoxiques (CTL). Cette coculture est ensuite évaluée par cytométrie de flux, à l’aide de marqueurs fluorescents pour des types cellulaires spécifiques. Enfin, le pourcentage de lyse iRBC par CTL est calculé en divisant la condition expérimentale par la rupture spontanée des globules rouges et le contrôle de la lyse spontanée, qui se produit pendant l’incubation sans la cellule effectrice. Dans l’ensemble, cette méthodologie de dosage meurtrier peut contribuer à une meilleure compréhension de l’immunité palustre à médiation cellulaire.

Protocol

Toutes les procédures ont été menées conformément aux politiques de la Fondation Oswaldo Cruz et du Conseil national d’éthique (CAAE: 59902816.7.0000.5091). Les protocoles humains ont été développés en collaboration avec le groupe de recherche clinique du Centre de recherche en médecine tropicale de Rondônia (CEPEM), chargé du recrutement des patients dans l’étude. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients. Pour l’étude animale, les procédures ont ét?…

Representative Results

Ici, la méthodologie appliquée pour l’isolement des globules rouges infectés par Plasmodium marqués au CFSE dans un essai de coculture avec des lymphocytes cytotoxiques est décrite. Tout d’abord, nous fournissons une représentation schématique de la façon d’exécuter le protocole, en utilisant des échantillons humains infectés par P. vivax (Figure 1). Ensuite, un organigramme illustré sur la façon de procéder avec le protocole dans un modèle expérimenta…

Discussion

Nous décrivons ici un test in vitro pour mesurer la destruction des globules rouges infectés par Plasmodium par les lymphocytes cytotoxiques. Ce test peut aider à élucider les mécanismes de l’immunité protectrice cellulaire au stade érythrocytaire du parasite du paludisme. Le principal avantage de cette méthodologie est qu’elle fournit un test quantitatif de la destruction cellulaire des iRBC qui peut être utilisé pour répondre à de nombreuses questions sur la façon dont les cellules im…

Materials

100 μM cell strainer	Corning	431752
96 Well Round (U) Bottom Plate	Thermo Scientific	12-565-65
Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody	Biolegend	349114	Used – APC anti-human CD235, dilution 1:100
Anti-human CD3 Antibody	Biolegend	317314	Used – PB anti-human CD3, dilution 1:200
Anti-human CD8 Antibody	Biolegend	344714	Used – APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200
Anti-human TCR Vδ2 Antibody	Biolegend	331408	Used – PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200
Anti-mouse CD8a Antibody	Biolegend	100733	Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody	Biolegend	116223	Used – APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Invitrogen	C34554
Fetal Bovine Serum, qualified	Gibco	26140079
Ficoll-Paque Plus	Cytiva	17144003	Lymphocyte Separation Medium (LSM)
Heparin Sodium Injection, USP	meithel pharma	71228-400-003	Used – 2000 USP units/2mL
Isoflurane	Piramal critical care	66794-0013-25
LS MACS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Bioscience
Percoll	Cytiva	17089101	Density Gradient Separation Medium (DGSM)
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093
Sodium bicarbonate, powder,  BioReagent	Sigma-Aldrich	S5761
Syringe With Sub-Q needle – 1mL, 26 gauge;	BD	14-829-10F
Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml	BD	366480