In Vitro Sitotoksik Lenfositler Tarafından Plazmodyum ile Enfekte Kırmızı Kan Hücresi Öldürme Testi
Summary
Burada, enfeksiyonun kan aşamasında Plasmodium’a hücresel bağışıklık mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olacak yeni bir yöntem tarif ediyoruz. Bu, sitotoksik lenfositler tarafından enfekte kırmızı kan hücresi öldürmeyi ölçen in vitro bir testtir.
Abstract
Sıtma, dünya çapında yılda 200 milyondan fazla vaka sunan önemli bir halk sağlığı sorunudur. Yıllarca süren bilimsel çabalara rağmen, sıtmaya karşı koruyucu bağışıklık, özellikle Plasmodium vivax için uzun süreli Plasmodium kültürünün metodolojik sınırlamaları nedeniyle hala tam olarak anlaşılamamıştır. Çoğu çalışma, sıtmanın kontrolünde önemli bir rol oynayan antikorlar tarafından sıtmaya karşı adaptif bağışıklık korumasına odaklanmıştır. Bununla birlikte, zayıflatılmış Plasmodium sporozoitler aşıları tarafından indüklenen steril koruma, hücresel yanıtla, özellikle CD8 + ve gama delta T hücreleri (γδ T) gibi sitotoksik T lenfositlerle ilişkilidir. Bu nedenle, hücresel immün yanıtın işlevlerini daha iyi kavramak ve böylece gelecekteki tedaviyi ve aşı gelişimini desteklemek için yeni metodolojiler geliştirilmelidir. Plasmodium kan evresi enfeksiyonuna karşı bu hücre aracılı bağışıklığı analiz etmek için yeni bir strateji bulmak için, grubumuz sitotoksik lenfositler tarafından enfekte kırmızı kan hücresi (iRBC) öldürmeyi ölçen bir in vitro tahlil kurdu. Bu tahlil, kan aşamasında farklı Plasmodium spp.’ye karşı hücresel bağışıklık tepkisi mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir. Doğuştan gelen ve adaptatif sitotoksik bağışıklık hücreleri, bir efektör: hedef mekanizmadaki iRBC’leri ve hücre içi paraziti doğrudan ortadan kaldırabilir. Hedef iRBC’ler hücre canlılığını değerlendirmek için etiketlenir ve efektör hücrelerle (CD8 + T, γδ T, NK hücreleri, vb.) birlikte kültürlenir. Lizis yüzdesi, akış sitometrisine dayalı bir tahlildeki spontan lizis kontrolüne kıyasla, test edilmiş koşullara dayanarak hesaplanır. Nihayetinde, bu öldürme testi metodolojisi, kan evresi sıtmasına karşı hücre aracılı bağışıklığı anlamada, yeni potansiyel terapötik hedeflerin ortaya çıkarılmasına ve sıtma aşılarının geliştirilmesinin hızlandırılmasına yardımcı olan büyük bir ilerlemedir.
Introduction
Sıtma, 2020 yılında bildirilen 240 milyondan fazla vaka ve 627.000 sıtmaya bağlı ölümle küresel bir sağlık krizi olmaya devam etmektedir1. Şu anda insanlarda sıtmaya neden olabilecek beş paraziter tür vardır, bunlardan Plasmodium falciparum ve Plasmodium vivax en yaygın iki türdür. Plasmodium enfeksiyonu sırasında, karaciğer veya eritrositik öncesi evre asemptomatiktir ve semptomlar sadece parazitin eritrositik evredeki aseksüel döngüsü sırasında ortaya çıkar. Bu enfeksiyon aşamasında, karaciğer aşamasından türetilen binlerce merozoit kan dolaşımına salınır ve kırmızı kan hücrelerini (RBC’ler) enfekte eder. RBC’de, parazitler şizogoni ile trofozoitlere ve şizontlara farklılaşır, ta ki şizontlar eritrositi parçalayana kadar, yeni oluşan merozoitleri serbest bırakarak bu kan döngüsünü tekrarlayana kadar. Tekrarlanan invazyon, replikasyon ve merozoit salınımı döngüleri, parazit popülasyonunun üstel büyümesine neden olur ve sonuçta hastalık semptomlarını tetikler2.
Sıtmaya karşı bağışıklık tepkisini incelemede önemli bir zorluk, Plasmodium spp. insanlara bulaşan laboratuvar hayvanı modellerine bulaşmaz. Bu nedenle, Plazmodyum ile enfekte olmuş hasta örnekleri taze toplanmalı ve derhal işlenmeli ve analiz edilmelidir. Bununla birlikte, sıtma endemik bölgelerinde, immünolojik ve moleküler mekanizmalara erişim kaynakları sınırlıdır. Bu sınırlamalar nedeniyle, kemirgenler Plasmodium enfeksiyonuna karşı bağışıklık tepkisini araştırmak için deneysel modeller olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. P. berghei ve P. chabaudi sıklıkla P. falciparum enfeksiyonu için vekil olarak kullanılırken, P. yoelii 17XNL’nin ölümcül olmayan suşu da retikülosit kısıtlı enfeksiyon 3,4 gibi P. vivax ile ortak birçok özelliğe sahiptir. İnsan veya hayvan modelinden türetilmiş örnekler için kullanılabilecek Plasmodium in vitro tahlillerinin geliştirilmesi, sıtmanın patogenezinin daha iyi anlaşılması ve parazitin farklı türlerinin ortaya çıkardığı immünolojik yanıtın karşılaştırılması açısından değerlidir.
Koruyucu antimalaryal bağışıklık, ne eritrositik öncesi aşamada ne de kan aşamasında tam olarak anlaşılamamıştır. Tekrarlayan enfeksiyonlara maruz kalmanın kısmi kazanılmış bağışıklık ile sonuçlandığı bilinmektedir, ancak steril bağışıklık nadiren gelişmektedir5. On yıllar boyunca, anti-Plasmodium koruyucu bağışıklık esas olarak, konakçı hücrelerin parazit invazyonunu önleyen veya antijen sunan hücreler tarafından fagositoza yol açan nötralize edici veya opsonize edici antikorların indüksiyonu ile ilişkiliydi,sırasıyla 6. Sonuç olarak, şimdiye kadar sıtma karşıtı aşılar üretme çabalarının çoğu, koruyucu ve uzun ömürlü antikorların indüklenmesine dayanmıştır 7,8. Bununla birlikte, zayıflatılmış bir sporozoit ile aşılama ile indüklenen steril koruma, sitotoksik T lenfositlerin aktivasyonu ve genişlemesi ile doğrudan ilişkilidir 8,9.
Son zamanlarda, yeni izole edilmiş hasta örnekleri ve in vitro kültürler üzerinde yapılan bazı çalışmalar, CD8 + T 10, γδ T11 ve NK hücreleri12 gibi doğuştan gelen veya adaptatif sitotoksik bağışıklık hücrelerinin, Plasmodium ile enfekte olmuş RBC’leri ve hücre içi parazitini efektör: hedef oranlı bir şekilde doğrudan ortadan kaldırabileceğini göstermiştir. Bu seminal bulgular, sıtma bağlamında tamamen yeni bir immün efektör mekanizmayı tanımlamıştır. Bu yeni antimalaryal bağışıklığı incelemek için, doğal enfeksiyon veya aşılamada enfekte olmuş RBC’lere (iRBC’ler) karşı öldürücü hücrelerin sitotoksik efektör mekanizmalarını araştırmak önemlidir.
Burada, lenfositlerin kan aşamasında sıtmaya karşı sitotoksik aktivitesini ölçen bir in vitro tahlil sunuyoruz. Bu tahlil daha sonra Plasmodium eritrosit aşamasına karşı hücresel bağışıklık tepkisinin mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olabilir. Hedef hücreler, iRBC’ler, hücre canlılığını değerlendirmek için karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE) ile etiketlenir ve daha sonra sitotoksik lenfositler (CTL) gibi efektör hücrelerle birlikte kültürlenir. Bu kokültür daha sonra spesifik hücre tipleri için floresan belirteçler kullanılarak akış sitometrisi ile değerlendirilir. Son olarak, CTL ile iRBC lizis yüzdesi, deneysel durumun RBC’lerin spontan rüptürü ve efektör hücre olmadan inkübasyon sırasında meydana gelen spontan lizis kontrolü ile bölünmesiyle hesaplanır. Genel olarak, bu öldürme testi metodolojisi, hücre aracılı sıtma bağışıklığının daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, sitotoksik lenfositler tarafından Plasmodium ile enfekte kırmızı kan hücresi öldürmeyi ölçmek için in vitro bir tahlil tarif ediyoruz. Bu tahlil, sıtma parazitinin eritrositik evresine hücresel koruyucu bağışıklık mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olabilir. Bu metodolojinin en büyük avantajı, bağışıklık hücrelerinin farklı Plasmodium spp ile nasıl etkileşime girdiği hakkında birçok soruyu ele almak için kullanılabilecek iRBC’lerin hücre aracı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Dhelio Pereira’ya ve Rondônia Tropikal Tıp Araştırma Merkezi (CEPEM) üyelerine sıtma hastası kaydı ve kan toplama için ve Felicia Ho’ya el yazması revizyonuna yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Aşağıdaki reaktif, Ana Rodriguez’in katkıda bulunduğu BEI Resources, NIAID, NIH ile elde edildi: Plasmodium yoelii subsp. yoelii, Strain 17XNL: PyGFP, MRA- 817. Bu araştırma Lemann Brezilya Araştırma Fonu, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) – 437851/2018-4, burslar (CJ, GC, CG) ve Fundação de Amparo do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) – APQ-00653-16, APQ-02962-18; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – burs (LL).
Materials
| 100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
| 96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
| Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used – APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
| Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used – PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
| Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used – APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
| Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used – PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used – APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
| Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
| Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used – 2000 USP units/2mL |
| Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
| LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
| Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
| Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe With Sub-Q needle – 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
| Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |
References
- WHO. Global Technical Strategy for Malaria 2016-2030, 2021 Update. World Health Organization. , (2021).
- Hafalla, J. C., Silvie, O., Matuschewski, K. Cell biology and immunology of malaria. Immunological Reviews. 240 (1), 297-316 (2011).
- Belnoue, E., et al. Vaccination with live Plasmodium yoelii blood stage parasites under chloroquine cover induces cross-stage immunity against malaria liver stage. Journal of Immunology. 181 (12), 8552-8558 (2008).
- Leong, Y. W., Lee, E. Q. H., Rénia, L., Malleret, B. Rodent malaria erythrocyte preference assessment by an ex vivo tropism assay. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 680136 (2021).
- Ladeia-Andrade, S., Ferreira, M. U., De Carvalho, M. E., Curado, I., Coura, J. R. Age-dependent acquisition of protective immunity to malaria in riverine populations of the amazon basin of Brazil. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 80 (3), 452-459 (2009).
- Antonelli, L. R., et al. The immunology of Plasmodium vivax malaria. Immunological Reviews. 293 (1), 163-189 (2020).
- Kazmin, D., et al. Systems analysis of protective immune responses to RTS, S malaria vaccination in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2425-2430 (2017).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8+ T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Draper, S. J., et al. Malaria vaccines: recent advances and new horizons. Cell Host & Microbe. 24 (1), 43-56 (2018).
- Junqueira, C., et al. γδ T cells suppress Plasmodium falciparum blood-stage infection by direct killing and phagocytosis. Nature Immunology. 22 (3), 347-357 (2021).
- Junqueira, C., et al. Cytotoxic CD8+ T cells recognize and kill Plasmodium vivax-infected reticulocytes. Nature Medicine. 24 (9), 1330-1336 (2018).
- Arora, G., et al. NK cells inhibit Plasmodium falciparum growth in red blood cells via antibody-dependent cellular cytotoxicity. eLife. 7, 36806 (2018).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. Lancet. 2 (8237), 70-71 (1981).
- Shaw-Saliba, K., et al. Insights into an optimization of Plasmodium vivax Sal-1 in vitro culture: the aotus primate model. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 0004870 (2016).
- Mehlotra, R. K., et al. Long-term in vitro culture of Plasmodium vivax isolates from Madagascar maintained in Saimiri boliviensis blood. Malaria Journal. 16 (1), 442 (2017).
- Hojo-Souza, N. S., et al. Contributions of IFN-γ and granulysin to the clearance of Plasmodium yoelii blood stage. PLOS Pathogens. 16 (9), 1008840 (2020).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J. C., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current Protocols in Immunology. 84 (1), 4-9 (2009).
- Migliaccio, A. R. Erythroblast enucleation. Haematologica. 95 (12), 1985 (2010).
- Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry Part A:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 73 (6), 546-554 (2008).
- Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 25 (3), 287-294 (1996).
- Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Experimental Parasitology. 62 (2), 275-282 (1986).
- Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 4 (3), 228-237 (1983).
- Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. American Journal of Hematology. 85 (4), 234 (2010).
- Montes, M., Jaensson, E. A., Orozco, A. F., Lewis, D. E., Corry, D. B. A general method for bead-enhanced quantitation by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 317 (1-2), 45-55 (2006).
