O presente protocolo descreve um método para extração de vesículas extracelulares do sangue periférico e tecidos sólidos com posterior perfilamento de antígenos de superfície e cargas proteicas.
As vesículas extracelulares (EVs) circulantes e residentes nos tecidos representam alvos promissores como novos biomarcadores teranósticos, e emergem como importantes atores na manutenção da homeostase do organismo e na progressão de um amplo espectro de doenças. Enquanto a pesquisa atual se concentra na caracterização de exossomos endógenos com origem endossomal, microvesículas que sopram da membrana plasmática têm ganhado atenção crescente na saúde e na doença, que são caracterizadas por uma abundância de moléculas de superfície recapitulando a assinatura da membrana das células parentais. Aqui, um procedimento reprodutível é apresentado baseado na centrifugação diferencial para extrair e caracterizar EVs do plasma e tecidos sólidos, como o osso. O protocolo descreve ainda o perfil subsequente de antígenos de superfície e cargas proteicas de EVs, que são rastreáveis por suas derivações e identificados com componentes relacionados à função potencial. Este método será útil para análise correlacional, funcional e mecanística de EVs em estudos biológicos, fisiológicos e patológicos.
Vesículas extracelulares (EVs) têm sido propostas para definir estruturas extracelulares liberadas de lipídios e fechadas por bicamadas1, que desempenham papéis importantes em vários eventos fisiológicos e patológicos2. Os EVs liberados por células saudáveis podem ser amplamente divididos em duas categorias principais, a saber, exossomos (ou pequenos EVs) formados através de uma via de tráfego endocítico intracelular3 e microvesículas (ou grandes EVs) desenvolvidas pelo brotamento externo da membrana plasmática da célula4. Enquanto muitos estudos enfocam a função dos EVs coletados de células cultivadas in vitro5, os EVs derivados da circulação ou tecidos são mais complexos e heterogêneos, o que tem a vantagem de refletir o verdadeiro estado do organismo in vivo6. Além disso, quase todos os tipos de tecidos podem produzir EVs in vivo, e esses EVs podem atuar como mensageiros dentro do tecido ou ser transferidos por vários fluidos corporais, especialmente o sangue periférico, para facilitar a comunicação sistêmica7. Os EVs na circulação e nos tecidos também são alvos para o diagnóstico e tratamento da doença8.
Enquanto os exossomos têm sido intensamente estudados nos últimos anos, as microvesículas também têm funções biológicas importantes, que podem ser facilmente extraídas sem ultracentrifugação, promovendo pesquisas básicas eclínicas9. Notadamente, uma questão crítica em relação aos EVs isolados da circulação e dos tecidos é que eles são derivados de diferentes tipos celulares10. Uma vez que as microvesículas são sopradas da membrana plasmática e caracterizadas por uma abundância de moléculas de superfície celular9, o uso de marcadores da membrana da célula de origem para identificar a origem celular desses EVs é viável. Especificamente, a técnica de citometria de fluxo (FC) pode ser aplicada para detectar marcadores de membrana. Além disso, os pesquisadores podem isolar os EVs e fazer análises adicionais com base nas cargas funcionais.
O presente protocolo fornece um procedimento minucioso para extração e caracterização de EVs de amostras in vivo. Os EVs são isolados via centrifugação diferencial, e a caracterização dos EVs inclui identificação morfológica via análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e microscopia eletrônica de transmissão (MET), análise de origem via FC e análise de carga proteica via western blot. O plasma sanguíneo e o osso maxilar de camundongos são usados como representantes. Os pesquisadores podem consultar este protocolo para EVs de outras fontes e fazer as modificações correspondentes.
Ao estudar as características, o destino e a função dos EVs, é crucial isolar EVs com alto rendimento e baixa contaminação. Existem vários métodos para extrair EVs, como centrifugação por gradiente de densidade (DGC), cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e ensaios de imunocaptura 4,20. Aqui, um dos métodos mais comumente utilizados, a centrifugação diferencial, foi usado; as vantagens disso são que não é demorado, gera um alto rendimento de…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32000974, 81870796, 82170988 e 81930025) e da Fundação de Ciência Pós-Doutoral da China (2019M663986 e BX20190380). Somos gratos pela assistência do National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).
4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |