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생물학

Isolamento e Análise de Vesículas Extracelulares Rastreáveis e Funcionalizadas do Plasma e Tecidos Sólidos

Published: October 17, 2022
doi:
10.3791/63990
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1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 3Department of VIP Dental Care, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 4School of Basic Medicine,The Fourth Military Medical University, 5College of Life Science,Northwest University, 6Xi’an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine

Summary

O presente protocolo descreve um método para extração de vesículas extracelulares do sangue periférico e tecidos sólidos com posterior perfilamento de antígenos de superfície e cargas proteicas.

Abstract

As vesículas extracelulares (EVs) circulantes e residentes nos tecidos representam alvos promissores como novos biomarcadores teranósticos, e emergem como importantes atores na manutenção da homeostase do organismo e na progressão de um amplo espectro de doenças. Enquanto a pesquisa atual se concentra na caracterização de exossomos endógenos com origem endossomal, microvesículas que sopram da membrana plasmática têm ganhado atenção crescente na saúde e na doença, que são caracterizadas por uma abundância de moléculas de superfície recapitulando a assinatura da membrana das células parentais. Aqui, um procedimento reprodutível é apresentado baseado na centrifugação diferencial para extrair e caracterizar EVs do plasma e tecidos sólidos, como o osso. O protocolo descreve ainda o perfil subsequente de antígenos de superfície e cargas proteicas de EVs, que são rastreáveis por suas derivações e identificados com componentes relacionados à função potencial. Este método será útil para análise correlacional, funcional e mecanística de EVs em estudos biológicos, fisiológicos e patológicos.

Introduction

Vesículas extracelulares (EVs) têm sido propostas para definir estruturas extracelulares liberadas de lipídios e fechadas por bicamadas1, que desempenham papéis importantes em vários eventos fisiológicos e patológicos2. Os EVs liberados por células saudáveis podem ser amplamente divididos em duas categorias principais, a saber, exossomos (ou pequenos EVs) formados através de uma via de tráfego endocítico intracelular3 e microvesículas (ou grandes EVs) desenvolvidas pelo brotamento externo da membrana plasmática da célula4. Enquanto muitos estudos enfocam a função dos EVs coletados de células cultivadas in vitro5, os EVs derivados da circulação ou tecidos são mais complexos e heterogêneos, o que tem a vantagem de refletir o verdadeiro estado do organismo in vivo6. Além disso, quase todos os tipos de tecidos podem produzir EVs in vivo, e esses EVs podem atuar como mensageiros dentro do tecido ou ser transferidos por vários fluidos corporais, especialmente o sangue periférico, para facilitar a comunicação sistêmica7. Os EVs na circulação e nos tecidos também são alvos para o diagnóstico e tratamento da doença8.

Enquanto os exossomos têm sido intensamente estudados nos últimos anos, as microvesículas também têm funções biológicas importantes, que podem ser facilmente extraídas sem ultracentrifugação, promovendo pesquisas básicas eclínicas9. Notadamente, uma questão crítica em relação aos EVs isolados da circulação e dos tecidos é que eles são derivados de diferentes tipos celulares10. Uma vez que as microvesículas são sopradas da membrana plasmática e caracterizadas por uma abundância de moléculas de superfície celular9, o uso de marcadores da membrana da célula de origem para identificar a origem celular desses EVs é viável. Especificamente, a técnica de citometria de fluxo (FC) pode ser aplicada para detectar marcadores de membrana. Além disso, os pesquisadores podem isolar os EVs e fazer análises adicionais com base nas cargas funcionais.

O presente protocolo fornece um procedimento minucioso para extração e caracterização de EVs de amostras in vivo. Os EVs são isolados via centrifugação diferencial, e a caracterização dos EVs inclui identificação morfológica via análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e microscopia eletrônica de transmissão (MET), análise de origem via FC e análise de carga proteica via western blot. O plasma sanguíneo e o osso maxilar de camundongos são usados como representantes. Os pesquisadores podem consultar este protocolo para EVs de outras fontes e fazer as modificações correspondentes.

Protocol

Os experimentos com animais foram realizados de acordo com as Diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Quarta Universidade Médica Militar e as diretrizes do ARRIVE. Para o presente estudo, camundongos C57Bl/6 com 8 semanas de idade (sem preferência por fêmeas ou machos) foram utilizados. As etapas envolvidas no isolamento dos EVs plasmáticos e teciduais estão ilustradas na Figura 1. O plasma é tomado como um representante para descrever o procedimento de isol…

Representative Results

De acordo com o fluxo de trabalho experimental, os VE podem ser extraídos do sangue periférico e dos tecidos sólidos (Figura 1). O osso maxilar de um camundongo com 8 semanas de idade é de aproximadamente 0,1 ± 0,05 g, e cerca de 300 μL de plasma podem ser coletados do camundongo. Seguindo as etapas do protocolo, 0,3 mg e 3 μg de VE podem ser coletados, respectivamente. Conforme analisado por MET e NTA, as características morfológicas típicas dos EVs são vesículas redondas de mem…

Discussion

Ao estudar as características, o destino e a função dos EVs, é crucial isolar EVs com alto rendimento e baixa contaminação. Existem vários métodos para extrair EVs, como centrifugação por gradiente de densidade (DGC), cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e ensaios de imunocaptura 4,20. Aqui, um dos métodos mais comumente utilizados, a centrifugação diferencial, foi usado; as vantagens disso são que não é demorado, gera um alto rendimento de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32000974, 81870796, 82170988 e 81930025) e da Fundação de Ciência Pós-Doutoral da China (2019M663986 e BX20190380). Somos gratos pela assistência do National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).

Materials

4% paraformaldehyde  Biosharp 143174 Transmission electron microscope
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody Yeason 34306ES60 Flow cytometry
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody Invitrogen A11008 Flow cytometry
Anti-CD18 antibody Abcam ab131044 Flow cytometry
Anti-CD81 antibody Abcam ab109201 Western blot
anti-CD9 antibody Huabio ET1601-9 Western blot
Anti-Mitofilin antibody Abcam ab110329 Western blot
APOA1 Rabbit pAb Abclone A14211 Western blot
BCA protein assay kit TIANGEN PA115 Western blot
BLUeye Prestained Protein Ladder Sigma-Aldrich 94964-500UL Western blot
Bovine serum albumin MP Biomedical 218072801 Western blot
Caveolin-1 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53564 Western blot
CellMask Orange plasma membrane stain Invitrogen C10045 Flow cytometry
Chemiluminescence Amersham Biosciences N/A Western blot
Curved operating scissor JZ Surgical Instrument J21040 EV isolation
Electronic balance Zhi Ke ZK-DST EV isolation
Epoch spectrophotometer BioTek N/A Western blot
Eppendorf tubes Eppendorf 3810X EV isolation
Flotillin-1 antibody PTM BIO PTM-5369 Western blot
Gel imaging system Tanon 4600 Western blot
Golgin84 Novus nbp1-83352 Western blot
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh Polysciences 24915 Transmission electron microscope
Heparin Solution StemCell  7980 EV isolation
Liberase Research Grade Sigma-Aldrich 5401127001 EV isolation
Microscopic tweezer JZ Surgical Instrument JD1020 EV isolation
NovoCyte flow cytometer ACEA N/A Flow cytometry
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells Epizyme LK206 Western blot
OSCAR(D-19) antibody Santa Cruz Biotechnology SC-34235 Flow cytometry
PBS (2x) ZHHC PW013 Western blot
Pentobarbital sodium Sigma-Aldrich 57-33-0 Anesthetization
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jacson 115-035-003 Western blot
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jacson 111-035-003 Western blot
Phosphotungstic acid RHAWN 12501-23-4 Transmission electron microscope
PKM2(d78a4) xp rabbit  mab  Cell Signaling 4053t Western blot
Polyethylene (PE) film Xiang yi 200150055 Transmission electron microscope
Polyvinylidene fluoride membranes  Roche 3010040001 Western blot
Protease inhibitors Roche 4693132001 Western blot
Recombinant anti-PGD antibody Abcam ab129199 Western blot
RIPA lysis buffer Beyotime P0013 Western blot
SDS-PAGE loading buffer (5x) Cwbio CW0027S Western blot
Size beads Invitrogen F13839 Flow cytometry
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges Hitachi CT15E EV isolation
Transmission electron microscope HITACHI H-7650 Transmission electron microscope
Tween-20 MP Biomedicals 19472 Western blot
Vortex Mixer Genie Scientific Industries SI0425 EV isolation
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 Particle Metrix N/A Nanoparticle tracking analysis
α-Actinin-4 Rabbit mAb Abclone A3379 Western blot
β-actin Cwbio CW0096M Western blot
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References

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Cao, Y., Qiu, J., Chen, D., Li, C., Xing, S., Zheng, C., Liu, X., Jin, Y., Sui, B. Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues. J. Vis. Exp. (188), e63990, doi:10.3791/63990 (2022).
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