Denne protokollen beskriver en metode for å ekstrahere ekstracellulære vesikler fra perifert blod og fast vev med påfølgende profilering av overflateantigener og proteinlaster.
Sirkulerende og vevsresidente ekstracellulære vesikler (EV) representerer lovende mål som nye teranostiske biomarkører, og de fremstår som viktige aktører i opprettholdelsen av organisatorisk homeostase og utviklingen av et bredt spekter av sykdommer. Mens den nåværende forskningen fokuserer på karakterisering av endogene eksosomer med endosomal opprinnelse, har mikrovesikler som blebber fra plasmamembranen fått økende oppmerksomhet i helse og sykdom, som er preget av en overflod av overflatemolekyler som rekapitulerer membransignaturen til foreldreceller. Her presenteres en reproduserbar prosedyre basert på differensiell sentrifugering for ekstrahering og karakterisering av EV fra plasma og fast vev, slik som beinet. Protokollen beskriver videre etterfølgende profilering av overflateantigener og proteinlaster av elbiler, som dermed er sporbare for deres derivasjoner og identifisert med komponenter relatert til potensiell funksjon. Denne metoden vil være nyttig for korrelativ, funksjonell og mekanistisk analyse av elbiler i biologiske, fysiologiske og patologiske studier.
Ekstracellulære vesikler (EV) har blitt foreslått for å definere cellefrigjorte lipid-dobbeltlags lukkede ekstracellulære strukturer1, som spiller viktige roller i ulike fysiologiske og patologiske hendelser2. EV frigjort av friske celler kan grovt deles inn i to hovedkategorier, nemlig eksosomer (eller små EV) dannet gjennom en intracellulær endocytisk trafikkvei3 og mikrovesikler (eller store EV) utviklet av den utadvendte spiringen av plasmamembranen til cellen4. Mens mange studier fokuserer på funksjonen til EV samlet fra dyrkede celler in vitro5, er EV avledet fra sirkulasjonen eller vevet mer komplekse og heterogene, som har fordelen av å reflektere den sanne tilstanden til organismen in vivo6. Videre kan nesten alle typer vev produsere EV in vivo , og disse EVene kan fungere som budbringere i vevet eller overføres av forskjellige kroppsvæsker, spesielt perifert blod, for å lette systemisk kommunikasjon7. Elbiler i sirkulasjon og vev er også mål for sykdomsdiagnose og behandling8.
Mens eksosomer har blitt intensivt studert de siste årene, har mikrovesikler også viktige biologiske funksjoner, som lett kan ekstraheres uten ultrasentrifugering, og dermed fremme grunnleggende og klinisk forskning9. Spesielt er et kritisk problem med elbiler isolert fra sirkulasjon og vev at de er avledet fra forskjellige celletyper10. Siden mikrovesikler blåses fra plasmamembranen og kjennetegnes av en overflod av celleoverflatemolekyler9, er det mulig å bruke foreldrecellemembranmarkører for å identifisere den cellulære opprinnelsen til disse EVene. Spesielt kan flowcytometri (FC) -teknikken brukes til å oppdage membranmarkører. Dessuten kan forskerne isolere elbilene og gjøre ytterligere analyser basert på de funksjonelle lastene.
Den nåværende protokollen gir en grundig prosedyre for å trekke ut og karakterisere elbiler fra in vivo-prøver. Elbilene er isolert via differensialsentrifugering, og karakteriseringen av elbiler inkluderer morfologisk identifikasjon via nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) og transmisjonselektronmikroskopi (TEM), opprinnelsesanalyse via FC og proteinfraktanalyse via western blot. Blodplasmaet og maksillærbenet av mus brukes som representanter. Forskere kan referere til denne protokollen for elbiler fra andre kilder og gjøre tilsvarende modifikasjoner.
Når man studerer funksjonene, skjebnen og funksjonen til elbiler, er det avgjørende å isolere elbiler med høy avkastning og lav forurensning. Det finnes ulike metoder for å trekke ut EV, for eksempel tetthetsgradientsentrifugering (DGC), størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) og immunfangstanalyser 4,20. Her ble en av de mest brukte metodene, differensialsentrifugering, brukt; Fordelene med dette er at det ikke er tidkrevende, det genererer et høyt utby…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (32000974, 81870796, 82170988 og 81930025) og China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 og BX20190380). Vi er takknemlige for hjelpen fra National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).
4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |