Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor de dissectie van vetdepots van muizen en de isolatie en vertering van de respectieve slagaders om de endotheelcelpopulatie te bevrijden en vervolgens te identificeren. Vers geïsoleerde cellen die worden gebruikt in downstream-toepassingen zullen het begrip van vasculaire celbiologie en de mechanismen van vasculaire disfunctie bevorderen.
Abstract
Vasculaire endotheelcellen langs de wand van het vasculaire systeem spelen een belangrijke rol in een verscheidenheid aan fysiologische processen, waaronder vasculaire tonusregulatie, barrièrefuncties en angiogenese. Endotheelceldisfunctie is een kenmerkende voorspeller en belangrijke drijfveer voor de progressie van ernstige hart- en vaatziekten, maar de onderliggende mechanismen blijven slecht begrepen. Het vermogen om endotheelcellen uit verschillende vaatbedden in hun oorspronkelijke vorm te isoleren en analyses uit te voeren, geeft inzicht in de processen van hart- en vaatziekten. Dit protocol presenteert de procedure voor de dissectie van subcutane en mesenteriale vetweefsels van muizen, gevolgd door isolatie van hun respectieve arteriële vasculatuur. De geïsoleerde slagaders worden vervolgens verteerd met behulp van een specifieke cocktail van spijsverteringsenzymen gericht op het bevrijden van functioneel levensvatbare endotheelcellen. Het verteerde weefsel wordt beoordeeld door middel van flowcytometrie-analyse met behulp van CD31 +/CD45−-cellen als markers voor positieve endotheelcelidentificatie. Cellen kunnen worden gesorteerd voor onmiddellijke downstream functionele assays of worden gebruikt om primaire cellijnen te genereren. De techniek van het isoleren en verteren van slagaders uit verschillende vaatbedden biedt onderzoekers opties om vers geïsoleerde vasculaire cellen uit slagaders van belang te evalueren en hen in staat te stellen een breed scala aan functionele tests op specifieke celtypen uit te voeren.
Introduction
Endotheelcellen staan bekend om hun belangrijke rol in een verscheidenheid aan fysiologische processen, waaronder barrièrefuncties, angiogenese en vasculaire tonusregulatie 1,2. Hoewel endotheelceldisfunctie goed gedocumenteerd is bij het bevorderen van atherosclerose, hypertensie, diabetes, enz., Blijven de onderliggende mechanismen die endotheeldisfunctie veroorzaken slecht begrepen en verschillen ze waarschijnlijk tussen verschillende vaatbedden 2,3,4. De poging om deze pathologische mechanismen van endotheelceldisfunctie te ontrafelen, wordt uitgedaagd door de beperkte toegang tot een zuivere populatie van endotheelcellen uit weefsels en/of de fenotypische veranderingen van endotheelcellen in cultuur 5,6. Daarom zal het kunnen isoleren en uitvoeren van analyses op endotheelcellen uit verschillende vaatbedden in hun oorspronkelijke vorm inzicht geven in de processen van hart- en vaatziekten.
Dit protocol presenteert de procedure om subcutane en mesenteriale vetweefsels van muizen te ontleden, gevolgd door isolatie van hun respectieve arteriële vasculatuur. Functioneel levensvatbare endotheelcellen langs de arteriële wanden worden bevrijd met behulp van een specifieke cocktail van enzymen. Speciale zorg werd besteed aan het optimaliseren van de omstandigheden van het spijsverteringsprotocol om een voldoende opbrengst van endotheelcellen te verkrijgen uit < 1 mg startweefsel, terwijl biomoleculaire markers intact bleven voor analyse. Geïsoleerde endotheelcellen worden vervolgens geïdentificeerd met behulp van flowcytometrie. De aanwezigheid van CD31 (PECAM) wordt voornamelijk gebruikt om endotheelcellen te identificeren. Vanwege de expressie van CD31 in andere celtypen, waaronder verschillende van hematopoietische oorsprong die ook CD45 tot expressie brengen, werd de zuiverheid van de geïsoleerde endotheelcellen verder verbeterd door de uitsluiting van cellen die zowel CD31 als CD45tot expressie brengen 5,6,7,8. Bovendien moeten onderzoekers, afhankelijk van de onderzoeksvraag en de downstream-toepassingen die moeten worden gebruikt, overwegen een uitgebreid panel van positieve en negatieve selectiemarkers te selecteren om de zuiverheid van de interessante celpopulatie te optimaliseren.
Hoewel de techniek van het ontleden en isoleren van vetdepotslagaders is gebruikt in de vorige publicaties 9,10,11,12,13, moet een gedetailleerd protocol dat de isolatie van ingebedde slagaders beschrijft nog worden gepresenteerd. Het demonstreren van de techniek voor de isolatie en vertering van slagaders uit verschillende vasculaire bedden van een bepaalde soort van belang zal onderzoekers opties bieden om vers geïsoleerde vasculaire cellen uit slagaders van belang te evalueren en hen in staat te stellen een breed scala aan functionele tests uit te voeren op specifieke celtypen. Tests kunnen omvatten, maar zijn niet beperkt tot flowcytometrie voor celsortering en membraaneiwitexpressie 5,8, elektrofysiologie voor ionkanaalactiviteit9, moleculaire profilering (proteomics / genomische analyses, enz.) 14,15, en de generatie van primaire cellijnen voor geneesmiddelenscreening in vitro 16,17.
Protocol
Het gebruik van dieren in deze studies werd goedgekeurd door de University of Delaware, Institutional Animal Care and Use Committee (# 1372).
1. Weefseldissectie en reiniging
OPMERKING: 10- tot 12 weken oude C57BL / 6J-muizen worden gebruikt in het videoprotocol. Raadpleeg figuur 1 voor het schema en het gewenste resultaat van weefseldissectie en reinigingsslagaders en raadpleeg de materiaaltabel voor de lijst met benodigdheden en informatie over de fabrikant.
- Euthanaseer de muis door CO 2-verstikking gevolgd door cervicale dislocatie.
- Bevestig de muis met dissectiepennen en spuit het ventrale oppervlak met 70% ethanol.
- Isolatie van onderhuids vetweefsel dat zich bij elke achtervel bevindt
OPMERKING: Ontleden gereedschap nodig: recht Bonn schaar (9 cm) en stompe, gebogen Graefe tang.- Gebruik een tang om de huid recht boven de geslachtsdelen te liften en maak een kleine (2 mm) incisie in de huid.
- Steek de punt van de schaar in de incisieplaats en maak een incisie van 4-5 cm in de middellijn, beginnend bij de eerste incisie en ontleed craniaal naar de basis van het borstbeen. Wees voorzichtig om de buikholte niet te penetreren.
- Maak een laterale incisie van 1 cm, die zich lateraal uitstrekt vanaf de middellijn direct onder de voorpoot.
- Maak een diagonale incisie van 1 cm tussen de achterste en geslachtsorganen.
- Maak kleine sneden langs de middellijn huidincisies om het bijbehorende bindweefsel weg te pellen en het onderhuidse vetdepot bloot te leggen. Speld de huid vast.
- Identificeer het "C-vormige" onderhuidse vetweefsel en de slagader / ader die loodrecht op de buikholte loopt.
- Begin vanaf de onderkant van de C-vorm in de buurt van de geslachtsorganen en pak voorzichtig het vetweefsel vast om het bindweefsel bloot te leggen. Maak kleine sneetjes in het bindweefsel om het vet van de huid te scheiden. Vermijd het verstoren van de blootgestelde vasculatuur.
- Ga door met het ontleden van het bindweefsel totdat het onderhuidse vetweefsel intact kan worden verwijderd. Scheid de blootgestelde slagader zorgvuldig van het omliggende bindweefsel.
- Bewaar het geïsoleerde onderhuidse vet in hepes-buffer op ijs totdat het klaar is om het vasculaire bed van belang te isoleren.
- Herhaal stap 1.3.3.-1.3.5. voor het resterende posterieure onderhuidse vetdepot.
- Isolatie van het mesenteriale vetstofdepot
OPMERKING: Ontleden gereedschap nodig: recht Bonn schaar (9 cm), Graefe tang, een paar # 5 tangen, rechte iris schaar, en gebogen Bonn schaar (9 cm).- Gebruik de Graefe-tang om de dunne peritoneale spouwwand boven de urineblaas op te tillen en maak een kleine incisie met een rechte schaar.
- Til langzaam de doorgedrongen peritoneale spouwwand op, steek voorzichtig de rechte irisschaar in de incisieplaats en maak een incisie van 4-5 cm van de urineblaas naar het borstbeen.
- Maak twee 1 cm lange horizontale incisies met de rechte irisschaar, die zich zijdelings uitstrekt vanaf de middellijn tot direct boven de achterpoot en onder de voorpoot. Gebruik de Graefe-tang om de buikspieren af te pellen en de peritoneale ingewanden bloot te leggen.
- Herhaal stap 1.4.3. aan de andere kant.
- Gebruik het paar # 5 tang om de darmen uit de viscerale holte te tillen om het mesenteriale vet te onthullen.
- Gebruik de gebogen schaar en # 5 tang om de vetstof langs de dikke darm te scheiden, beginnend bij het caecum tot waar de dikke darm uit het zicht afdaalt.
- Keer terug naar het caecum en gebruik de gebogen schaar en # 5 tang om de vetstof langs de dunne darm naar de alvleesklier te scheiden. Verwijder een klein deel van de alvleesklier om het mesenteriale vet volledig te isoleren.
OPMERKING: Het verwijderen van een klein deel van de alvleesklier samen met het mesenteriale vet kan helpen bij het reinigen van de slagaders, omdat het stabiliteit biedt tijdens het reinigen. - Bewaar het geïsoleerde mesenteriale vet in hepes-buffer op ijs totdat het klaar is om de mesenteriale slagaders te isoleren.
- Isolatie van de respectieve slagaders uit onderhuidse en mesenteriale vetweefsels
OPMERKING: Ontleden gereedschap nodig: een ontleed schotel en stereoscoop met een lichtbron, een paar # 55 tangen en een paar # 5 tang.- Plaats ~ 10 ml koude HEPES-buffer in de ontleedschaal en breng het vetweefsel over naar de schaal met behulp van de # 5-tang.
- Gebruik de stereoscoop bij 1x vergroting om het vetweefsel te bekijken en te positioneren om het slagader/aderpaar(en) bloot te leggen (figuur 2).
- Gebruik de #55 tang om voorzichtig het parenchymale vet uit de slagader te verwijderen. Verwijder kleine stukjes vet per keer en observeer zorgvuldig slagader / aderparen onder de stereoscoop om de vasculatuur van belang te identificeren en te voorkomen.
NOTITIE: Pas de vergroting en lichtbron dienovereenkomstig aan om de slagaders schoon te maken. Verhoog de vergroting en lichtintensiteit om de slagaders beter te kunnen zien als vet wordt verwijderd. Fijne reiniging van de slagaders moet worden gedaan onder 4x-5x vergroting. Het is belangrijk om onderscheid te maken tussen bindweefsels (collageen), aderen en slagaders. Bindweefsels en collageenvezels hebben een touwachtig uiterlijk zonder takken, zijn gestreept en hebben een witachtige kleur. In tegenstelling tot collageenvezels en bindweefsels zijn slagaders en aderen transparant en hebben ze meerdere takken met een gedefinieerd lumen. Kleine slagaders en aderen kunnen er qua uiterlijk hetzelfde uitzien wanneer ze vrij zijn van parenchymaal weefsel. De aanwezigheid van bloed in het lumen kan verder helpen om de slagaders uit aderen te identificeren. Aderen hebben dunnere bloedvatwanden en een groter lumen en bevatten meer bloed in vergelijking met slagaders van vergelijkbare grootte. - Herhaal stap 1.5.3. totdat de slagaders volledig vrij zijn van parenchymaal vetweefsel.
- Gebruik # 5 tang om de gereinigde slagaders over te brengen naar een nieuwe buis met verse HEPES-buffer en houd op ijs totdat het klaar is voor de spijsvertering.
2. Vertering van geïsoleerde slagaders voor isolatie van endotheelcellen
OPMERKING: Raadpleeg figuur 2 voor het schema van weefselvertering en isolatie van endotheelcellen en de tabel met materialen voor een volledige lijst van benodigdheden die nodig zijn voor het protocol.
- Voeg 1 mg dispase en elastase toe aan elke microcentrifugebuis van 2 ml. Voeg 2 ml dissociatieoplossing toe aan elke buis. Vortex en incuberen bij 37 °C totdat ze volledig zijn opgelost. Gebruik #5 tang om de gereinigde slagaders (stap 1.5.5.) over te brengen naar de respectievelijke monsterbuizen. De uiteindelijke concentratie van elk enzym is 0,5 mg / ml.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur met zachte agitatie door inversie om de 10-15 minuten, zodat de slagaders in oplossing worden gesuspendeerd om consistent en uniform contact tussen de enzymen en slagaders te behouden.
- Weeg 1 mg collagenase type I per monster af en voeg het toe aan nieuwe tubes.
- Laat de slagaders zich aan de onderkant van de buis nestelen. Verwijder 500 μL van de buffer van bovenaf zonder de slagaders te verstoren en breng deze over in aangewezen buizen die collagenase bevatten. Vortex en breng de oplossing terug naar de respectieve monsters in de oorspronkelijke monsterbuizen. De uiteindelijke concentratie collagenase type I is 0,5 mg/ml.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 15 min. Zorg ervoor dat de slagaders in stukken scheiden na kort schudden van de monsterbuis. Als de slagaders na verstoring niet in stukken uiteenvallen, incubeer dan in stappen van 5 minuten totdat de arteriële afbraak zichtbaar is.
- Gebruik een glazen pipet om het verteerde weefsel 10x-15x krachtig te tritureren om de cellen mechanisch te dissociëren.
- Laat de oplossing en het verteerde weefsel door een celzeef van 70 μm of een flowcytometriebuiszeef lopen om eencellige suspensies te verkrijgen.
3. Kleuring van endotheelcellen voorafgaand aan flowcytometrie
OPMERKING: De kleuring en verwerking van endotheelcellen worden uitgevoerd op ijs om de levensvatbaarheid van cellen te verbeteren, tenzij geïnstrueerd. De 5 ml polystyreen buizen met ronde bodem worden gecentrifugeerd bij 1.163 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Centrifugeer de eencellige suspensies bij 1.163 x g gedurende 3 minuten bij RT.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 1 ml PBS + 5% BSA gedurende 30 minuten op RT.
OPMERKING: Onderzoekers moeten overwegen FC-receptoren te blokkeren, afhankelijk van het celtype, het doelwit van interesse en het gebruikte antilichaam18,19. - Voeg 1 μL cel levensvatbaarheidsvlek (405 nm excitatie) toe (Tabel van materialen) en incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij RT.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 1.163 x g gedurende 3 minuten bij RT. Resuspendeer de celpellet in 200 μL PBS + 1% BSA.
- Voeg aan de monsters primaire antilichamen toe die zijn geconjugeerd aan CD31 (CD31-PE, 0,75 μg / monster) en CD45 (CD45-FITC, 2,5 μg / monster) en incubeer op een rocker in de koelkast gedurende 15 minuten nadat de monsters met aluminiumfolie zijn bedekt.
OPMERKING: Om een zuivere populatie van endotheelcellen te identificeren en/of te verkrijgen, moet u zowel CD31 als CD45 onderzoeken met behulp van CD31- en CD45-geconjugeerde primaire antilichamen met verschillende excitatie-/emissiefluorescentie en poort-/sorteercellen met een CD31+CD45−-expressieprofiel. Compensatie kan nodig zijn afhankelijk van de gebruikte fluoroforen 18,20,21. - Was de cellen door 1 ml PBS + 1% BSA rechtstreeks aan de celsuspensie toe te voegen.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 1.163 x g gedurende 3 minuten bij RT. Verwijder het supernatant en resuspendeer in 200 μL van 1% formaldehyde met 0,1% BSA. Bewaar in de koelkast bedekt met aluminiumfolie tot het klaar is voor flowcytometrie.
OPMERKING: De celopbrengsten worden verbeterd door de was- en centrifugatiestappen te verminderen. Deze moeten mogelijk worden gewijzigd, afhankelijk van de uitkomstbenadering. Het monster in fixatief moet binnen 24 uur worden geanalyseerd.
Representative Results
Een schema van de workflow wordt weergegeven in figuur 1. Het schema belicht de protocolstappen die in meer detail in de protocoltekst worden beschreven. Figuur 2 toont foto's van onderhuids vet (figuur 2A, links) na dissectie en een onderhuidse arterie arcade (figuur 2A, rechts) na reiniging van het parenchymale weefsel. Figuur 2 toont ook het mesenteriale vet (figuur 2B, links) na dissectie en de mesenteriale arteriële arcade (figuur 2B, rechts) na reiniging van het parenchymale weefsel.
Het hier gepresenteerde protocol is bedoeld om onderzoekers te helpen die mogelijk geïnteresseerd zijn in a) het vergelijken van verschillende vetdepotvaculatuurbedden in fundamentele wetenschappelijke benaderingen en / of ziektemodellen, b) de vertering van vaatbedden voorafgaand aan isolatie van vasculaire cellen van belang voor downstream-toepassing, en c) het gebruik van flowcytometrie om vasculaire cellen van belang te identificeren (figuur 3 ) voor een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder, maar niet beperkt tot, eiwitexpressieanalyses zoals hier uitgevoerd (figuur 4). Figuur 3 beschrijft een voorbeeld van onze aanpak om endotheelcellen uit verteerde muizenslagaders te identificeren met behulp van flowcytometrie. Celpreparaten verkregen uit verteerde subcutane (figuur 3A) of mesenteriale (figuur 3B) vetslagaders werden gekleurd met CD31-PE, CD45-FITC en een kleurstof voor de levensvatbaarheid van cellen voorafgaand aan de fixatie en identificatie van levensvatbare CD31+CD45− endotheelcellen met behulp van flowcytometrie, zoals elders op dezelfde manier uitgevoerd8. De levensvatbaarheidsvlek van de cel maakte de identificatie mogelijk van alleen die levensvatbare cellen die het isolatie- en spijsverteringsprotocol overleefden voorafgaand aan de fixatie. Het gebruik van deze methode zal onderzoekers in staat stellen om de expressie of functie van levensvatbare vasculaire cellen van belang te beoordelen.
Om te bepalen of endotheelcellen geïsoleerd uit verschillende vetdepot vasculatuur verschillen vertoonden in membraaneiwitexpressie, werden geïsoleerde cellen onderzocht op de vetzuurtranslocase, CD36 (figuur 4), omdat onlangs werd aangetoond dat dit membraaneiwit essentieel is in de endotheel-gemedieerde distributie van vetzuren naar weefsels22 . Daarom kan het bepalen van de relatieve expressieverschillen tussen membraan CD36, bijvoorbeeld in verschillende vaatbedden, a) bestaande gegevens ondersteunen met betrekking tot differentiële voorkeur voor vetzuurgebruik tussen verschillende weefsels en / of b) potentiële nieuwe verschillen in weefselverdeling van vetzuren in gezondheid en ziekte onthullen. Uit dezelfde preparaten van verteerde vasculaire cellen als voorbeeld in figuur 3 werden CD31+CD45−CD36+ endotheelcellen geïdentificeerd in subcutane (figuur 4A) en mesenteriale (figuur 4B) vetweefsel, en CD36-expressie werd gekwantificeerd in deze populatie in elk vaatbed. Figuur 4C en figuur 4D laten zien dat zowel het percentage endotheelcellen dat CD36 tot expressie brengt als de intensiteit van CD36-expressie groter waren in subcutane endotheelcellen in vergelijking met dat waargenomen in mesenteriale endotheelcellen. Deze voorlopige bevindingen ondersteunen het gebruik van onze methodologie om duidelijke verschillen tussen vaatbedden te identificeren.
Figuur 1: Werkschema om endotheelcellen te isoleren uit subcutane en viscerale vetweefsels voor downstream-toepassingen. (A) 10-12 weken oude C57BL / 6J-muizen werden geëuthanaseerd en gebruikt om deze procedure aan te tonen. (Bi) Eerst wordt het onderhuidse vet verwijderd. (Bii) Vervolgens wordt het mesenteriale (viscerale) vetweefsel verwijderd. De witte stippellijnen geven de locaties aan van de onderhuidse (links) en mesenteriale (rechts) vetdepots na de dissectie en verwijdering. De respectievelijke slagaders zijn geïsoleerd voor downstream-toepassingen. (C) In dit protocol worden geïsoleerde slagaders vervolgens verteerd met behulp van een specifieke enzymcocktail als eerste stap in het bevrijden van functioneel levensvatbare endotheelcellen. (D) Geïsoleerde endotheelcellen worden geïdentificeerd door te tasten naar CD31+ en CD45− cellen met behulp van geconjugeerde antilichamen voorafgaand aan flowcytometrieanalyse. Cellen met een expressieprofiel van CD31+/CD45− zijn de endotheelcellen die van belang zijn voor aanvullende analyses. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Geïsoleerde onderhuidse en viscerale vetweefsels en respectievelijke slagaders. (A) Links: Geïsoleerd "C-vormig" onderhuids vetweefsel van achterpoten. Een belangrijke tak van de onderhuidse vetslagader, aangeduid met pijl (1), wordt onthuld wanneer parenchymale vetstof wordt verwijderd. Rechts: Geïsoleerde onderhuidse vetslagaders. (B) Links: Het mesenteriale (viscerale) vetweefsel wordt geïsoleerd uit de darm. Rechts: De respectievelijke arteriële arcade wordt geïsoleerd door het parenchymale weefsel te verwijderen. Er worden verschillende schalen gebruikt tussen de foto's van vetweefsel (5 mm) en slagaders (1 mm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Identificatie van endotheelcellen na arteriële weefselvertering via flowcytometrie. Representatieve percelen met cellen die vrijkomen uit geïsoleerde (A) subcutane of (B) mesenteriale vetslagaders. Cellen werden blootgesteld aan geconjugeerde antilichamen die zich richtten op extracellulaire epitopen van CD31 (PE) en CD45 (FITC) voorafgaand aan fixatie. Flowcytometrie werd gebruikt om de CD31+CD45−endotheelcelpopulatie te identificeren. Een cel levensvatbaarheidskleuring werd gebruikt om alleen de cellen te selecteren die de isolatie- en verteringsprotocollen overleefden voor latere analyses. Bovendien zal een passende gating in dit stadium een beoogde celpopulatie verder scheiden van verontreinigende cellen als de grootte van het celtype van belang bekend is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Analyse van CD36-membraanexpressie in subcutane versus mesenteriale vetslagader endotheelcellen via flowcytometrie. Representatieve populatieplots en histogrammen die endotheel CD36 (APC) membraanexpressie tonen in (A) subcutane of (B) mesenteriale vetslagaders. (C) Percentage endotheelcellen (EC's) die CD36 tot expressie brengen in subcutane versus mesenteriale EC's (n = 5, 3 mannen, 2 vrouwtjes; *p < 0,05 na de t-test van student). (D) Genormaliseerde EC-membraan CD36-expressie in subcutane versus mesenteriale vetslagaders (n = 5, 3 mannen, 2 vrouwen; * p < 0,05 na de t-test van student). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Endotheeldisfunctie is een voorloper van ernstige ziektetoestanden, die waarschijnlijk de ontwikkeling van atherosclerose, hypertensie en beroerte stimuleren 3,23. Hoewel de geïdentificeerde mechanismen die ten grondslag liggen aan endotheeldisfunctie in een bepaalde pathologische aandoening talrijk zijn, zullen verschillende vasculaire bedden waarschijnlijk differentieel worden beïnvloed door pathologische aandoeningen 4,24. Bovendien induceren verschillende cardiovasculaire risicofactoren (bijv. Obesitas, hypertensie, dyslipidemie, roken, diabetes) disfunctie via een verscheidenheid aan verschillende mechanismen23,25. Daarom is het van cruciaal belang om endotheelcelpopulaties te isoleren van gevestigde diermodellen van ziekte of toegankelijk menselijk weefsel en testen uit te voeren op cellen die onmiddellijk uit de in vivo omgeving zijn verwijderd. Het op deze manier isoleren van cellen heeft een uniek voordeel ten opzichte van het bestuderen van cellen in cultuur, omdat ze geen cultuur-geïnduceerde fenotypische veranderingen hebben 5,6. Bovendien, het opnemen van een heterogene endotheelcelpopulatie, zoals waargenomen in vivo26,27 (en die verder kan worden gescheiden met behulp van flow-assisted celsortering), van een levend organisme, informeert de in vivo omgeving beter. Ten slotte is deze methode van toepassing op het onderzoek van talrijke diermodellen en mogelijk menselijk weefsel en kan deze worden gebruikt om primaire celkweeklijnen te genereren, indien een dergelijke behoefte gerechtvaardigd is.
De kritieke stap in dit protocol, en de stap die het meest moet worden aangepast voor verschillende vasculaire bedden of celtypen die hier niet worden gepresenteerd, is de vertering van vasculair weefsel. Deze stap moet worden geoptimaliseerd voor de gezondheid van cellen zonder de celopbrengst te verminderen. De specifieke enzymen die worden gebruikt en de duur van de spijsvertering zijn van cruciaal belang voor het optimaliseren van de celgezondheid en -opbrengst om downstream-testen adequaat te kunnen uitvoeren. Voor de identificatie van membraanexpressie van CD36, zoals gedetecteerd door flowcytometrie in subcutane en mesenteriale endotheelcellen (figuur 4), werd een aangepaste versie van het verteringsprotocol ontwikkeld dat oorspronkelijk was ontworpen voor patch-clamp elektrofysiologie28 . Dit omvatte een verlenging van de collagenase I-verteringstijd tot 30 minuten om de celopbrengst te verhogen om beter te voldoen aan de eisen van flowcytometrie versus wat nodig is voor patch-clamp-studies. Aangezien deze wijziging de gezondheid van de cellen tot op zekere hoogte kan beïnvloeden, werd in de flowcytometrieanalyses een cel levensvatbaarheidskleuring gebruikt om ervoor te zorgen dat alleen levensvatbare endotheelcellen volgens dit protocol werden beoordeeld (figuur 3). Het wordt aanbevolen dat studies gericht op het isoleren van cellen uit vasculair weefsel een marker voor de levensvatbaarheid van cellen bevatten voordat de gewenste aanpak wordt beoordeeld.
Het beschreven protocol is voldoende om levensvatbare endotheelcellen vrij te maken voor analyse en downstream-toepassingen van ≤1 mg arteriële monsters afgeleid van muizen; als de slagaders van belang echter zouden worden geïsoleerd uit verschillende weefsels of organismen (bijv. Mensen) die zouden resulteren in significant verschillende arteriële massa's, zou men het gehalte aan spijsverteringsenzymen en de duur van de incubatie moeten optimaliseren om de celpopulatie van belang efficiënt te isoleren. Voor sommige vaatbedden die beginnen met nog kleinere hoeveelheden startweefsel dan de hier gepresenteerde subcutane en mesenteriale bedden (bijv. kransslagaders), kan het samenvoegen van slagaders van verschillende muizen per monster nodig zijn. Dit kan inderdaad een noodzakelijke stap zijn voor een bepaald vaatbed, aangezien de uitkomstbenadering een relatief hoge celopbrengst vereist. Een belangrijke beperking is dat, vanwege de aard van variaties per monstervertering, de celopbrengsten soms aanzienlijk kunnen verschillen tussen batches, zelfs wanneer ze uit hetzelfde vaatbed komen. Dit kan problemen veroorzaken bij het analyseren van gegevens en moet indien nodig via normalisatie worden verantwoord. Cd36-expressie was bijvoorbeeld extreem variabel in de ruwe gegevens als gevolg van veranderingen in celopbrengsten in individuele monsters van subcutane en mesenteriale vetslagaders. Daarom werden ruwe gegevens genormaliseerd tot CD31 +CD45− gemiddelde fluorescentie-intensiteit met de veronderstelling dat deze methode zou corrigeren voor batchverschillen (figuur 4). Natuurlijk kunnen, afhankelijk van de aanpak, meer geavanceerde statistische analyses en normalisatiemethoden nodig zijn.
Samenvattend presenteert dit artikel een methode om subcutane en mesenteriale slagaders van muizen te ontleden, isoleren en verteren om de expressie en / of functie van endotheeldoelen van belang te onderzoeken. Met aanpassingen aan het gepresenteerde protocol kunnen verschillende vaatbedden en celtypen (bijvoorbeeld gladde spiercellen) worden onderzocht. Dit protocol, als basis voor een overvloed aan beschikbare experimentele benaderingen, heeft het potentieel om het begrip van vasculaire celbiologie en mechanismen van vasculaire disfunctie te bevorderen.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
In liefdevolle herinnering aan Rich West, een briljante wetenschapper, collega en goede vriend. We willen de University of Delaware Flow Cytometry en BioImaging Core als onderdeel van het Delaware Biotechnology Institute bedanken voor hun voortdurende bijdragen aan onze studies. We willen ook Emma Hudgins bedanken voor de zorgvuldige beoordeling en bewerking van het manuscript. Ons werk wordt ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). Dit project werd ook ondersteund door het Delaware INBRE-programma, met een subsidie van de NIGMS (P20GM103446) van de National Institutes of Health en de staat Delaware (I.S. Fancher), en een University of Delaware General University Research grant (I.S. Fancher). Deze inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue dissection tools | |||
| 5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
| 55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
| Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
| Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
| Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
| Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
| Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
| Solutions Recipes | |||
| HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
| Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
| Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
| Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
| CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
| CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
| Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |
References
- Krüger-Genge, A., Blocki, A., Franke, R. P., Jung, F. Vascular endothelial cell biology: An update. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), 4411 (2019).
- Choi, S., Kim, J. A., Kim, K. C., Suh, S. H. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 19 (1), 35-42 (2015).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Nunan, E., et al. Obesity as a premature aging phenotype - Implications for sarcopenic obesity. Geroscience. , (2022).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1599-1604 (1997).
- Amici, S. A., Dong, J., Guerau-de-Arellano, M. Molecular mechanisms modulating the phenotype of macrophages and microglia. Frontiers in Immunology. 8, 1520 (2017).
- Patel, J., et al. Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key SoxF-dependent differentiation process. Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K+ channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. The Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- Ahn, S. J., et al. Cholesterol-induced suppression of endothelial Kir channels is a driver of impairment of arteriolar flow-induced vasodilation in humans. Hypertension. 79 (1), 126-138 (2022).
- Ahn, S. J., et al. Differential effects of obesity on visceral versus subcutaneous adipose arteries: Role of shear-activated Kir2.1 and alterations to the glycocalyx. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 322 (2), 156-166 (2022).
- Fancher, I. S., et al. Impairment of flow-sensitive inwardly rectifying K(+) channels via disruption of glycocalyx mediates obesity-induced endothelial dysfunction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (9), 240-255 (2020).
- van Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: Specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Research. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Ades, E. W., et al. HMEC-1: Establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. Journal of Investigative Dermatology. 99 (6), 683-690 (1992).
- Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncology Reports. 15 (2), 381-386 (2006).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), e54641 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine Peyer's patches. Journal of Visualized Experiments. (73), e50167 (2013).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of cell suspensions isolated from solid tissues by spectral flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Son, N. -H., et al. Endothelial cell CD36 optimizes tissue fatty acid uptake. The Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4329-4342 (2018).
- Bakker, W., Eringa, E. C., Sipkema, P., van Hinsbergh, V. W. M. Endothelial dysfunction and diabetes: roles of hyperglycemia, impaired insulin signaling and obesity. Cell and Tissue Research. 335 (1), 165-189 (2008).
- Farb, M. G., Gokce, N. Visceral adiposopathy: A vascular perspective. Hormone Molecular Biology and Clinical Investigation. 21 (2), 125-136 (2015).
- Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. International Journal of Obesity. 26 (6), 754-764 (2002).
- Cleuren, A. C. A., et al. The in vivo endothelial cell translatome is highly heterogeneous across vascular beds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (47), 23618-23624 (2019).
- Aird, W. C.
- Sonkusare, S. K., Dalsgaard, T., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Inward rectifier potassium (Kir2.1) channels as end-stage boosters of endothelium-dependent vasodilators. The Journal of Physiology. 594 (12), 3271-3285 (2016).
