Summary
Этот протокол подробно описывает метод рассечения жировых депо мышей и выделения и переваривания соответствующих артерий для высвобождения, а затем идентификации популяции эндотелиальных клеток. Свежеизолированные клетки, используемые в последующих приложениях, будут способствовать пониманию биологии сосудистых клеток и механизмов сосудистой дисфункции.
Abstract
Сосудистые эндотелиальные клетки, выстилающие стенку сосудистой системы, играют важную роль в различных физиологических процессах, включая регуляцию тонуса сосудов, барьерные функции и ангиогенез. Дисфункция эндотелиальных клеток является отличительным предиктором и основным фактором прогрессирования тяжелых сердечно-сосудистых заболеваний, но основные механизмы остаются плохо изученными. Возможность выделения и проведения анализов эндотелиальных клеток из различных сосудистых русл в их родном виде даст представление о процессах сердечно-сосудистых заболеваний. В этом протоколе представлена процедура рассечения подкожной и брыжеечной жировой клетчатки мышей с последующей изоляцией их соответствующих артериальных сосудов. Изолированные артерии затем перевариваются с использованием определенного коктейля пищеварительных ферментов, ориентированных на высвобождение функционально жизнеспособных эндотелиальных клеток. Переваренную ткань оценивают с помощью анализа проточной цитометрии с использованием клеток CD31+/CD45− в качестве маркеров для положительной идентификации эндотелиальных клеток. Клетки могут быть отсортированы для непосредственных последующих функциональных анализов или использованы для генерации первичных клеточных линий. Метод выделения и переваривания артерий из разных сосудистых русл предоставит исследователям возможность оценить свежеизолированные сосудистые клетки из интересующих артерий и позволит им выполнять широкий спектр функциональных тестов на конкретных типах клеток.
Introduction
Эндотелиальные клетки хорошо известны своей важной ролью в различных физиологических процессах, включая барьерные функции, ангиогенез и регуляцию тонуса сосудов 1,2. Хотя дисфункция эндотелиальных клеток хорошо документирована в продвижении атеросклероза, гипертонии, диабета и т. Д., Основные механизмы, приводящие к эндотелиальной дисфункции, остаются плохо изученными и, вероятно, различаются между различными сосудистыми руслами 2,3,4. Попытка разгадать эти патологические механизмы дисфункции эндотелиальных клеток оспаривается ограниченным доступом к чистой популяции эндотелиальных клеток из тканей и/или фенотипическими изменениями эндотелиальных клеток в культуре 5,6. Таким образом, возможность выделения и выполнения анализов эндотелиальных клеток из различных сосудистых русл в их родной форме даст представление о процессах сердечно-сосудистых заболеваний.
Этот протокол представляет процедуру рассечения подкожной и брыжеечной жировой клетчатки у мышей с последующим выделением их соответствующей артериальной сосудистой системы. Функционально жизнеспособные эндотелиальные клетки, выстилающие артериальные стенки, высвобождаются с помощью специфического коктейля ферментов. Особое внимание было уделено оптимизации условий протокола пищеварения для получения достаточного выхода эндотелиальных клеток из <1 мг исходной ткани при сохранении биомолекулярных маркеров нетронутыми для анализа. Изолированные эндотелиальные клетки затем идентифицируются с помощью проточной цитометрии. Присутствие CD31 (PECAM) используется в первую очередь для идентификации эндотелиальных клеток. Благодаря экспрессии CD31 в других типах клеток, включая некоторые из них кроветворного происхождения, которые также экспрессируют CD45, чистота изолированных эндотелиальных клеток была дополнительно повышена путем исключения клеток, экспрессирующих как CD31, так и CD45 5,6,7,8. Кроме того, в зависимости от исследовательского вопроса и последующих приложений, которые будут использоваться, исследователи должны рассмотреть возможность выбора обширной панели положительных и отрицательных маркеров отбора для оптимизации чистоты интересующей популяции клеток.
Хотя метод рассечения и изоляции артерий жирового депо использовался в предыдущих публикациях 9,10,11,12,13, подробный протокол, описывающий изоляцию встроенных артерий, еще не представлен. Демонстрация техники выделения и переваривания артерий из разных сосудистых русл из данного вида, представляющего интерес, предоставит исследователям возможность оценить свежеизолированные сосудистые клетки из интересующих артерий и позволит им выполнить широкий спектр функциональных тестов на конкретных типах клеток. Испытания могут включать, но не ограничиваются ими, проточную цитометрию для сортировки клеток и экспрессии мембранного белка 5,8, электрофизиологию активностиионных каналов 9, молекулярное профилирование (протеомика/геномный анализ и т.д.). 14,15, а генерация первичных клеточных линий для скрининга лекарств in vitro16,17.
Protocol
Использование животных в этих исследованиях было одобрено Университетом штата Делавэр, Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (#1372).
1. Рассечение и очистка тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: В видеопротоколе используются мыши C57BL/6J возрастом от 10 до 12 недель. Пожалуйста, обратитесь к рисунку 1 для схемы и желаемого результата рассечения тканей и очистки артерий и обратитесь к Таблице материалов для получения списка расходных материалов и информации о производителе.
- Усыпляют мышь путем удушьяCO2 с последующим вывихом шейки матки.
- Закрепите мышь с помощью рассеченных штифтов и распылите на вентральную поверхность 70% этанола.
- Выделение подкожных жировых тканей, расположенных у каждого задней конечности
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимые инструменты для рассечения: прямые боннские ножницы (9 см) и тупые, изогнутые щипцы Graefe.- Используйте щипцы, чтобы поднять кожу прямо над гениталиями и сделать небольшой (2 мм) разрез в коже.
- Вставьте кончик ножниц в место разреза и сделайте разрез средней линии 4-5 см, начиная с начального разреза и рассекая краниально до основания грудины. Будьте осторожны, чтобы не проникнуть в брюшную полость.
- Сделайте боковой разрез 1 см, простирающийся латерально от средней линии непосредственно под передней конечностью.
- Сделайте диагональный разрез 1 см между задней конечностью и половыми органами.
- Сделайте небольшие разрезы вдоль средней линии разрезов кожи, чтобы отклеить связанную соединительную ткань и обнажить подкожное жировое депо. Закрепите кожу.
- Определите «С-образную» подкожную жировую клетчатку и артерию/вену, которая проходит перпендикулярно брюшной полости.
- Начните с нижней части формы С возле гениталий и осторожно захватите жировую ткань, чтобы обнажить соединительные ткани. Сделайте небольшие разрезы в соединительной ткани, чтобы отделить жир от кожи. Избегайте нарушения открытых сосудов.
- Продолжайте рассечение соединительной ткани до тех пор, пока подкожная жировая клетчатка не будет удалена неповрежденной. Тщательно отделите открытую артерию от окружающей соединительной ткани.
- Храните изолированный подкожный жировой слой в буфере HEPES на льду до тех пор, пока не будете готовы изолировать интересующее сосудистое русло.
- Повторите шаги 1.3.3.-1.3.5. для оставшегося заднего подкожного жирового депо.
- Выделение брыжеечного жирового депо
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимые инструменты для рассечения: прямые ножницы Бонна (9 см), щипцы Graefe, пара щипцов No5, прямые ножницы для радужной оболочки глаза и изогнутые ножницы Бонна (9 см).- Используйте щипцы Graefe, чтобы поднять тонкую стенку брюшной полости над мочевым пузырем и сделать небольшой разрез с помощью прямых ножниц.
- Медленно поднимите пробитую стенку брюшной полости, аккуратно вставьте в место разреза прямые ножницы радужной оболочки и сделайте разрез 4-5 см от мочевого пузыря до грудины.
- Сделайте два горизонтальных разреза длиной 1 см прямыми ножницами радужной оболочки, простираясь сбоку от средней линии до непосредственно над задней конечностью и ниже передней конечности. Используйте щипцы Graefe, чтобы отшелушить мускулатуру живота и обнажить брюшиные внутренние органы.
- Повторите шаг 1.4.3. на противоположной стороне.
- Используйте пару щипцов No5, чтобы поднять кишечник из висцеральной полости, чтобы выявить брыжеечный жировой слой.
- Используйте изогнутые ножницы и щипцы No 5, чтобы отделить жировую часть вдоль толстой кишки, начиная от слепой кишки до того места, где толстая кишка опускается от поля зрения.
- Вернитесь в слепую кишку и используйте изогнутые ножницы и щипцы No5, чтобы отделить жировую клетчатку вдоль тонкой кишки до поджелудочной железы. Удалить небольшую часть поджелудочной железы, чтобы полностью выделить брыжеечный жировой слой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление небольшой части поджелудочной железы вместе с брыжеечным жиром может помочь в очистке артерий, поскольку оно обеспечивает стабильность во время очистки. - Храните изолированный брыжеечный жир в буфере HEPES на льду до тех пор, пока не будете готовы изолировать брыжеечные артерии.
- Выделение соответствующих артерий из подкожной и брыжеечной жировой клетчатки
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимые инструменты для рассечения: рассекающая тарелка и стереоскоп с источником света, пара щипцов #55 и пара щипцов #5.- Поместите ~10 мл холодного буфера HEPES в рассекающую посуду и переложите жировую ткань в тарелку с помощью щипцов No5.
- Используйте стереоскоп при 1-кратном увеличении для просмотра и позиционирования жировой ткани для обнажения пары (пар) артерия/вена (рисунок 2).
- Используйте щипцы No55, чтобы аккуратно удалить паренхиматозный жир из артерии. Удаляйте небольшие кусочки жировой массы за один раз и внимательно наблюдайте пары артерий / вен под стереоскопом, чтобы идентифицировать и избежать повреждения интересующей сосудистой системы.
ЗАМЕТКА: Отрегулируйте увеличение и источник света соответствующим образом, чтобы очистить артерии. Увеличьте увеличение и интенсивность света, чтобы лучше видеть артерии при удалении жировой ткани. Тонкая очистка артерий должна проводиться под 4-5-кратным увеличением. Важно различать соединительные ткани (коллагены), вены и артерии. Соединительные ткани и коллагеновые волокна имеют струнообразный вид без ветвей, поперечно-полосатые, имеют беловатый цвет. В отличие от коллагеновых волокон и соединительных тканей, артерии и вены прозрачны и имеют несколько ветвей с определенным просветом. Мелкие артерии и вены могут казаться похожими по внешнему виду, когда свободны от паренхиматозной ткани. Наличие крови в просвете может еще больше помочь идентифицировать артерии из вен. Вены имеют более тонкие стенки кровеносных сосудов и больший просвет и содержат больше крови по сравнению с артериями сопоставимого размера. - Повторите шаг 1.5.3. до тех пор, пока артерии полностью не освободятся от паренхиматозной жировой ткани.
- Используйте щипцы No5 для переноса очищенных артерий в новую трубку со свежим буфером HEPES и держите на льду до готовности к пищеварению.
2. Переваривание изолированных артерий для выделения эндотелиальных клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к рисунку 2 для схемы переваривания тканей и выделения эндотелиальных клеток и к Таблице материалов для полного списка материалов, необходимых для протокола.
- Добавьте по 1 мг диспазы и эластазы в каждую микроцентрифужную трубку 2 мл. Добавьте 2 мл диссоциационного раствора в каждую пробирку. Вихрь и инкубируют при 37 °C до полного растворения. Используйте щипцы No5 для переноса очищенных артерий (этап 1.5.5.) в соответствующие пробирки. Конечная концентрация каждого фермента составляет 0,5 мг/мл.
- Инкубировать при 37 °C в течение 1 ч с мягким перемешиванием путем инверсии каждые 10-15 мин, так что артерии суспендируют в растворе для поддержания последовательного и равномерного контакта между ферментами и артериями.
- Взвесьте 1 мг коллагеназы типа I на образец и добавьте его в новые пробирки.
- Дайте артериям осесть в нижней части трубки. Удалите 500 мкл буфера сверху, не нарушая артерий, и перенесите его в назначенные трубки, содержащие коллагеназу. Вихрь и возврат раствора к соответствующим образцам в исходных пробах. Конечная концентрация коллагеназы I типа составляет 0,5 мг/мл.
- Инкубировать при 37 °C в течение 15 мин. Убедитесь, что артерии разделяются на кусочки после кратковременного встряхивания пробирки. Если артерии не разделяются на кусочки после возмущения, инкубируйте с шагом в 5 минут, пока не будет виден разрушение артерий.
- Используя стеклянную пипетку, энергично тритурируйте переваренную ткань 10x-15x, чтобы механически диссоциировать клетки.
- Пропустите раствор и переваренную ткань через клеточный сетчатый фильтр 70 мкм или сетчатый фильтр проточной цитометрической трубки для получения одноклеточных суспензий.
3. Окрашивание эндотелиальных клеток перед проточной цитометрией
ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание и обработка эндотелиальных клеток проводят на льду для улучшения жизнеспособности клеток, если не указано иное. Полистирольные трубки круглого дна объемом 5 мл центрифугируются при 1,163 х г в течение 3 мин при комнатной температуре (RT).
- Центрифугировать одноэлементные суспензии при 1,163 х г в течение 3 мин при РТ.
- Удалить надосадочный материал и повторно суспендировать ячейку гранулы в 1 мл PBS + 5% BSA в течение 30 мин при RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователи должны рассмотреть возможность блокирования рецепторов FC в зависимости от типа клетки, мишени, представляющей интерес, и антител, используемых18,19. - Добавляют 1 мкл пятна жизнеспособности клеток (возбуждение 405 нм) (Таблица материалов) и инкубируют в темноте в течение 30 мин при РТ.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 1,163 х г в течение 3 мин при RT. Повторно суспендируют ячейку гранулы в 200 мкл PBS + 1% BSA.
- К образцам добавляют первичные антитела, конъюгированные с CD31 (CD31-PE, 0,75 мкг/образец) и CD45 (CD45-FITC, 2,5 мкг/образец) и инкубируют на коромысле в холодильнике в течение 15 мин после покрытия образцов алюминиевой фольгой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для идентификации и/или получения чистой популяции эндотелиальных клеток исследуйте как CD31, так и CD45 с использованием CD31- и CD45-конъюгированных первичных антител с отчетливой флуоресценцией возбуждения/эмиссии и затвором/сортировкой клеток с профилем экспрессии CD31+CD45−. Компенсация может потребоваться в зависимости от используемых флуорофоров 18,20,21. - Промывайте клетки, добавляя 1 мл PBS + 1% BSA непосредственно в клеточную суспензию.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 1,163 х г в течение 3 мин при РТ. Удаляют надосадочное вещество и повторно суспендируют в 200 мкл 1% формальдегида с 0,1% BSA. Хранить в холодильнике, покрытом алюминиевой фольгой, до готовности к проточной цитометрии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выход ячеек улучшается за счет уменьшения стадий промывки и центрифугирования. Возможно, их потребуется изменить в зависимости от подхода, основанного на результатах. Образец в фиксаторе должен быть проанализирован в течение 24 ч.
Representative Results
Схема рабочего процесса показана на рисунке 1. Схема выделяет шаги протокола, описанные более подробно в тексте протокола. На рисунке 2 показаны изображения подкожной жировой клетчатки (рисунок 2А, слева) после рассечения и аркады подкожной артерии (рисунок 2А, справа) после очистки паренхиматозной ткани. На рисунке 2 также показаны брыжеечный жировой слой (рисунок 2B, слева) после рассечения и брыжеечная артериальная аркада (рисунок 2B, справа) после очистки паренхиматозной ткани.
Протокол, представленный здесь, предназначен для оказания помощи исследователям, потенциально заинтересованным в а) сравнении различных сосудистых пластов жирового депо в подходах фундаментальной науки и / или моделях заболеваний, б) переваривании сосудистых лож до выделения сосудистых клеток, представляющих интерес для последующего применения, и в) использовании проточной цитометрии для идентификации сосудистых клеток, представляющих интерес (рисунок 3). ) для различных применений, включая, но не ограничиваясь, анализ экспрессии белка, как это выполнено здесь (рисунок 4). На рисунке 3 приведен пример нашего подхода к идентификации эндотелиальных клеток из переваренных артерий мыши с помощью проточной цитометрии. Клеточные препараты, полученные из переваренных подкожных (Фиг.3А) или брыжеечных (Фиг.3В) жировых артерий, окрашивали CD31-PE, CD45-FITC и красителем жизнеспособности клеток до фиксации и идентификации жизнеспособных CD31+CD45− эндотелиальных клеток с помощью проточной цитометрии, как аналогично выполнено в другом месте8. Окрашивание жизнеспособности клеток позволяло идентифицировать только те жизнеспособные клетки, которые пережили протокол выделения и пищеварения до фиксации. Использование этого метода позволит исследователям оценить экспрессию или функцию жизнеспособных сосудистых клеток, представляющих интерес.
Чтобы определить, проявляли ли эндотелиальные клетки, выделенные из различных сосудистых сосудов жирового депо, различия в экспрессии мембранного белка, изолированные клетки исследовали на предмет транслоказы жирных кислот, CD36 (рисунок 4), поскольку недавно было показано, что этот мембранный белок необходим в эндотелиально-опосредованном распределении жирных кислот втканях 22 . Таким образом, определение относительных различий в экспрессии между мембранными CD36, например, в различных сосудистых руслах может а) поддержать существующие данные о дифференциальном предпочтении использования жирных кислот среди различных тканей и/или б) выявить потенциальные новые различия в тканевом распределении жирных кислот в здоровье и болезни. Из тех же препаратов переваренных сосудистых клеток, как показано на рисунке 3, CD31 +CD45−CD36+ эндотелиальные клетки были идентифицированы в подкожном (Рисунок 4A) и брыжеечном (Рисунок 4B) жировике, и экспрессия CD36 была количественно определена в этой популяции в каждом сосудистом русле. Рисунок 4C и Рисунок 4D показывают, что как процент эндотелиальных клеток, экспрессирующих CD36, так и интенсивность экспрессии CD36 были выше в подкожных эндотелиальных клетках по сравнению с тем, что наблюдалось в брыжеечных эндотелиальных клетках. Эти предварительные результаты подтверждают использование нашей методологии для выявления четких различий между сосудистыми руслами.
Рисунок 1: Рабочая схема выделения эндотелиальных клеток из подкожной и висцеральной жировой клетчатки для последующего применения. (A)10-12-недельные мыши C57BL/6J были усыплены и использованы для демонстрации этой процедуры. (Би) Сначала удаляется подкожный жировой слой. (Бии) Затем впоследствии удаляется брыжеечная (висцеральная) жировая ткань. Белые пунктирные линии указывают на расположение подкожных (слева) и брыжеечных (справа) жировых депо после рассечения и удаления. Соответствующие артерии изолированы для последующих применений. (C) В этом протоколе изолированные артерии затем перевариваются с использованием специфического ферментного коктейля в качестве первого шага в освобождении функционально жизнеспособных эндотелиальных клеток. (D) Изолированные эндотелиальные клетки идентифицируют путем зондирования cd31+ и CD45− клеток с использованием конъюгированных антител до анализа проточной цитометрии. Клетки с профилем экспрессии CD31+/CD45− являются эндотелиальными клетками, представляющими интерес для дополнительного анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изолированные подкожные и висцеральные жировые ткани и соответствующие артерии. (А) Слева: Изолированная «С-образная» подкожная жировая клетчатка из задних конечностей. Основная ветвь подкожной жировой артерии, обозначаемая стрелкой (1), выявляется при удалении паренхиматозного жира. Справа: Изолированные подкожные жировые артерии. (B) Слева: брыжеечная (висцеральная) жировая ткань выделена из кишечника. Справа: соответствующая артериальная аркада изолируется путем удаления паренхиматозной ткани. Различные чешуйки используются между снимками жировой массы (5 мм) и артерий (1 мм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Идентификация эндотелиальных клеток после переваривания артериальной ткани с помощью проточной цитометрии. Репрезентативные графики, показывающие клетки, освобожденные из изолированных (А) подкожных или (В) брыжеечных жировых артерий. Клетки подвергались воздействию конъюгированных антител, которые нацеливались на внеклеточные эпитопы CD31 (PE) и CD45 (FITC) до фиксации. Проточная цитометрия использовалась для идентификации популяции эндотелиальных клеток CD31+CD45−. Окрашивание жизнеспособности клеток использовалось для отбора только тех клеток, которые пережили протоколы выделения и пищеварения для последующих анализов. Кроме того, соответствующая обработка на этом этапе будет дополнительно отделять предполагаемую клеточную популяцию от загрязняющих клеток, если будет известен размер интересующего типа клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ экспрессии мембраны CD36 в клетках эндотелия подкожной и брыжеечной жировой артерии с помощью проточной цитометрии. Репрезентативные популяционные графики и гистограммы, показывающие экспрессию эндотелиальной CD36 (APC) мембраны в (A) подкожных или (B) брыжеечных жировых артериях. (C) Процент эндотелиальных клеток (ЭК), экспрессирующих CD36 в подкожных и брыжеечных ЭК (n = 5, 3 самца, 2 женщины; *p < 0,05 после t-теста Стьюдента). (D) Нормализованная экспрессия CD36 мембраны EC в подкожных и брыжеечных жировых артериях (n = 5, 3 мужчины, 2 женщины; *p < 0,05 после t-теста Стьюдента). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Эндотелиальная дисфункция является предшественником тяжелых болезненных состояний, вероятно, приводящих к развитию атеросклероза, гипертонии и инсульта 3,23. В то время как выявленные механизмы, лежащие в основе эндотелиальной дисфункции при данном патологическом состоянии, многочисленны, различные сосудистые русла, вероятно, будут по-разному зависеть от патологических состояний 4,24. Кроме того, различные сердечно-сосудистые факторы риска (например, ожирение, гипертония, дислипидемия, курение, диабет) вызывают дисфункцию с помощью различных различных механизмов23,25. Поэтому крайне важно изолировать популяции эндотелиальных клеток из установленных животных моделей заболевания или доступных тканей человека и выполнять анализы на клетках, немедленно удаленных из среды in vivo. Выделение клеток таким образом имеет уникальное преимущество перед изучением клеток в культуре в том, что они лишены вызванных культурой фенотипических изменений 5,6. Кроме того, включая гетерогенную популяцию эндотелиальных клеток, наблюдаемую in vivo26,27 (и которая может быть дополнительно отделена с помощью сортировки клеток с помощью потока), от живого организма лучше информирует среду in vivo. Наконец, этот метод применим к исследованию многочисленных животных моделей и, возможно, тканей человека и может быть использован для генерации первичных линий клеточной культуры, если такая необходимость оправдана.
Критическим шагом в этом протоколе и шагом, который потребует наибольшей корректировки для различных сосудистых русл или типов клеток, не представленных здесь, является пищеварение сосудистой ткани. Этот шаг должен быть оптимизирован для здоровья клеток без уменьшения выхода клеток. Специфические используемые ферменты и продолжительность пищеварения имеют решающее значение для оптимизации здоровья клеток и выхода, чтобы иметь возможность адекватно выполнять последующие анализы. Для идентификации мембранной экспрессии CD36, обнаруженной с помощью проточной цитометрии в подкожных и брыжеечных эндотелиальных клетках (фиг.4), была разработана модифицированная версия протокола пищеварения, первоначально разработанная для электрофизиологии пластырного зажима28 . Это включало в себя увеличение времени переваривания коллагеназы I до 30 мин для увеличения выхода клеток для лучшего удовлетворения требований проточной цитометрии по сравнению с тем, что требуется для исследований зажима. Поскольку эта модификация может в некоторой степени влиять на здоровье клеток, пятно жизнеспособности клеток использовалось в анализах проточной цитометрии, чтобы гарантировать, что только жизнеспособные эндотелиальные клетки оценивались в соответствии с этим протоколом (рисунок 3). Рекомендуется, чтобы исследования, направленные на выделение клеток из сосудистой ткани, включали маркер жизнеспособности клеток до оценки желаемого подхода.
Описанный протокол достаточен для высвобождения жизнеспособных эндотелиальных клеток для анализа и последующего применения из артериальных образцов ≤1 мг, полученных от мышей; однако, если бы интересующие артерии были выделены из различных тканей или организмов (например, людей), что привело бы к значительному различию артериальных масс, пришлось бы оптимизировать содержание ферментов пищеварения и продолжительность инкубации, чтобы эффективно изолировать интересующую клеточную популяцию. Для некоторых сосудистых ложек, которые начинаются с еще меньшего количества исходной ткани, чем подкожное и брыжеечное русла, представленные здесь (например, коронарные артерии), может потребоваться объединение артерий нескольких мышей на образец. Действительно, это может быть необходимым шагом для любого сосудистого русла, учитывая, что подход к результату требует относительно высокого выхода клеток. Основным ограничением является то, что из-за характера вариаций на переваривание образца выходы клеток иногда могут значительно различаться в разных партиях, даже если они находятся в одном и том же сосудистом русле. Это может вызвать проблемы при анализе данных и должно быть учтено путем нормализации, когда это необходимо. Например, экспрессия CD36 была чрезвычайно изменчивой в исходных данных из-за изменений в выходе клеток в отдельных образцах подкожных и брыжеечных жировых артерий. Поэтому необработанные данные были нормализованы до средней интенсивности флуоресценции CD31+CD45− с предположением, что этот метод будет корректировать разности партий (рисунок 4). Конечно, в зависимости от подхода могут потребоваться более сложные статистические анализы и методы нормализации.
Таким образом, в этой статье представлен метод рассечения, выделения и переваривания подкожных и брыжеечных артерий мышей для исследования экспрессии и / или функции эндотелиальных мишеней, представляющих интерес. С модификациями представленного протокола могут быть исследованы различные сосудистые русла и типы клеток (например, гладкомышечные клетки). Этот протокол, как основа для множества доступных экспериментальных подходов, имеет потенциал для продвижения понимания биологии сосудистых клеток и механизмов сосудистой дисфункции.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
В память о Риче Уэсте, блестящем ученом, коллеге и дорогом друге. Мы хотели бы поблагодарить Университет Делавэра по проточной цитометрии и BioImaging Core в рамках Института биотехнологии штата Делавэр за их постоянный вклад в наши исследования. Мы также хотели бы поблагодарить Эмму Хаджинс за тщательное рецензирование и редактирование рукописи. Нашу работу поддерживает Национальный институт общих медицинских наук P20GM113125-6564 (И.С. Фанчер). Этот проект также был поддержан программой DELAWARE INBRE, с грантом NIGMS (P20GM103446) от Национальных институтов здравоохранения и штата Делавэр (I.S. Fancher) и грантом Университета Делавэра General University Research (I.S. Fancher). Этот контент является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue dissection tools | |||
| 5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
| 55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
| Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
| Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
| Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
| Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
| Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
| Solutions Recipes | |||
| HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
| Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
| Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
| Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
| CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
| CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
| Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |
References
- Krüger-Genge, A., Blocki, A., Franke, R. P., Jung, F. Vascular endothelial cell biology: An update. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), 4411 (2019).
- Choi, S., Kim, J. A., Kim, K. C., Suh, S. H. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 19 (1), 35-42 (2015).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Nunan, E., et al. Obesity as a premature aging phenotype - Implications for sarcopenic obesity. Geroscience. , (2022).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1599-1604 (1997).
- Amici, S. A., Dong, J., Guerau-de-Arellano, M. Molecular mechanisms modulating the phenotype of macrophages and microglia. Frontiers in Immunology. 8, 1520 (2017).
- Patel, J., et al. Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key SoxF-dependent differentiation process. Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K+ channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. The Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- Ahn, S. J., et al. Cholesterol-induced suppression of endothelial Kir channels is a driver of impairment of arteriolar flow-induced vasodilation in humans. Hypertension. 79 (1), 126-138 (2022).
- Ahn, S. J., et al. Differential effects of obesity on visceral versus subcutaneous adipose arteries: Role of shear-activated Kir2.1 and alterations to the glycocalyx. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 322 (2), 156-166 (2022).
- Fancher, I. S., et al. Impairment of flow-sensitive inwardly rectifying K(+) channels via disruption of glycocalyx mediates obesity-induced endothelial dysfunction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (9), 240-255 (2020).
- van Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: Specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Research. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Ades, E. W., et al. HMEC-1: Establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. Journal of Investigative Dermatology. 99 (6), 683-690 (1992).
- Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncology Reports. 15 (2), 381-386 (2006).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), e54641 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine Peyer's patches. Journal of Visualized Experiments. (73), e50167 (2013).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of cell suspensions isolated from solid tissues by spectral flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Son, N. -H., et al. Endothelial cell CD36 optimizes tissue fatty acid uptake. The Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4329-4342 (2018).
- Bakker, W., Eringa, E. C., Sipkema, P., van Hinsbergh, V. W. M. Endothelial dysfunction and diabetes: roles of hyperglycemia, impaired insulin signaling and obesity. Cell and Tissue Research. 335 (1), 165-189 (2008).
- Farb, M. G., Gokce, N. Visceral adiposopathy: A vascular perspective. Hormone Molecular Biology and Clinical Investigation. 21 (2), 125-136 (2015).
- Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. International Journal of Obesity. 26 (6), 754-764 (2002).
- Cleuren, A. C. A., et al. The in vivo endothelial cell translatome is highly heterogeneous across vascular beds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (47), 23618-23624 (2019).
- Aird, W. C.
- Sonkusare, S. K., Dalsgaard, T., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Inward rectifier potassium (Kir2.1) channels as end-stage boosters of endothelium-dependent vasodilators. The Journal of Physiology. 594 (12), 3271-3285 (2016).
