פיגומים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים משולבים ממוטות מיקרוג'ל
Summary
מוטות מיקרוג’ל עם קבוצות תגובתיות משלימות מיוצרים באמצעות מיקרופלואידיקה עם היכולת להתחבר בתמיסה מימית. המיקרוג’לים האניזומטריים נתקעים ומתחברים למבנים יציבים עם נקבוביות גדולות יותר בהשוואה למערכות מבוססות כדוריות. מיקרו-ג’לים שעברו שינוי עם GRGDS-PC יוצרים מבנים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים שיכולים לשמש לתרבית תאים.
Abstract
מערכת דו-רכיבית של מיקרוג’לים פונקציונליים ממיקרופלואידיקה מאפשרת קישור מהיר למבנים מקרו-נקבוביים תלת-ממדיים בתמיסות מימיות ללא תוספים נוספים. ג’לציה רציפה על השבב מאפשרת וריאציה של יחס הגובה-רוחב של המיקרוג’ל, הקובע את תכונות אבני הבניין עבור המבנים המתקבלים. מונומרים של גליצידיל מתקרילט (GMA) או 2-אמינואתיל מתקרילט (AMA) עוברים קופולימריזציה לרשת המיקרו-ג’ל על בסיס פולימרים של פוליאתילן גליקול (PEG) כדי להשיג פונקציונליות של אפוקסי או אמין. זרימת שמן ממוקדת מוחדרת למבנה השקע המיקרופלואידי כדי להבטיח איסוף רציף של מוטות המיקרוג’ל הפונקציונליים. בהתבסס על פרסום שפורסם לאחרונה, מבנים מבוססי מוטות מיקרוג’ל גורמים לנקבוביות גדולות יותר של כמה מאות מיקרומטרים, ובמקביל מובילים ליציבות פיגומים גבוהה יותר באופן כללי בהשוואה למודל מבוסס כדוריות. בדרך זו, ניתן לייצר מבנים בנפח גבוה יותר עם נפח חופשי יותר תוך הפחתת כמות החומר הנדרשת. הפיגומים המקרו-נקבוביים המחוברים זה לזה ניתנים לאיסוף ולהובלה ללא נזק או התפוררות. קבוצות אמין ואפוקסי שאינן מעורבות בקישור הדדי נשארות פעילות וניתן להשתמש בהן באופן עצמאי לאחר השינוי. פרוטוקול זה מתאר שיטה אופטימלית לייצור מוטות מיקרוג’ל ליצירת פיגומים מקרו-נקבוביים מקושרים שיכולים לשמש לניסויים הבאים בתאים.
Introduction
כדי לחקור התנהגות מורכבת של תאים שיתופיים במבנים תלת-ממדיים, פלטפורמות פיגומים צריכות להראות ביצועים עקביים ביכולת השחזור, להיות בעלות גיאומטריה מתאימה לנדידת תאים, ובמקביל לאפשר גמישות מסוימת במונחים של שינוי פרמטרים כדי לחקור את השפעתם על הרקמה החיה1. בשנים האחרונות, הרעיון של חלקיקים מקרו-נקבוביים (MAP), שתואר לראשונה על ידי Segura et al., התפתח לפלטפורמה יעילה ורב-תכליתית לייצור פיגומים תלת-ממדיים2. ההרכב המותאם של המיקרו-ג’לים, שהם אבני הבניין של הפיגום התלת-ממדי הסופי, מגדיר מראש תכונות כגון קשיחות המבנה, התגובתיות הכימית הסלקטיבית של רשת הג’ל וגודל הנקבוביות הסופי של הפיגום 2,3,4,5,6. פפטידים דביקים של תאים כרמזים לאינטראקציות פיגומים-תאים משולבים ברשת הפולימרים של המיקרו-ג’לים כדי לאפשר חיבור של תאים, וניתן לגוון אותם כדי לחקור את ההשפעות הספציפיות שלהם על תאים בתרבית. הפיגומים התלת-ממדיים מיוצבים על ידי קישור של המיקרו-ג’לים הניתנים להזרקה בחישול עקב קשרים קוולנטיים או סופראמולקולריים, וכתוצאה מכך מבנים חזקים ומוגדרים עבור תרבית תאים 2,3,5,7,8.
Microfluidics ביססה את עצמה כאחת השיטות המדויקות והניתנות להתאמה להכנת הידרוג’לים גרעיניים מוגדרים9. האפשרות לייצר כמויות גדולות יותר של אבני הבניין הנדרשות בתהליך מתמשך תוך שמירה על חד-פעמיותן הכימית, המכנית והפיזיקלית, תורמת רבות להתאמתו של תהליך זה. יתר על כן, ניתן לתפעל את הגודל והצורה של המיקרו-ג’לים המיוצרים בשיטות שונות כגון תחליבי אצווה, מיקרופלואידיקה, ליתוגרפיה, ריסוס אלקטרודינמי או פיצול מכני, הקובעים את הגיאומטריה של אבני הבניין, ולפיכך, את המבנה התלת-ממדי של הפיגום הסופי 1,10.
לאחרונהדווח על הרעיון של פיגומים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים המורכבים ממוטות מיקרוג’ל פונקציונליים המתחברים במהירות בתמיסות מימיות ללא תוספים נוספים. האניזוטרופיה של מוטות מיקרוג’ל הביאה לנקבוביות גבוהות יותר ולהתפלגות נקבוביות עם גודל נקבוביות גדול יותר בהשוואה לשימוש במיקרו-ג’לים כדוריים במחקר זה11. באופן זה, פחות חומר יוצר נקבוביות גדולות יותר עם מגוון גיאומטריות נקבוביות שונות תוך שמירה על יציבות הפיגום התלת-ממדי. המערכת מורכבת משני סוגים של מוטות מיקרוג’ל עם קבוצות פונקציונליות משלימות של אמין ראשוני ואפוקסי הנצרכים בתוך התגובה ההדדית כאשר באים במגע זה עם זה. הקבוצות הפונקציונליות שאינן משתתפות בתהליך הקישור נשארות פעילות וניתן להשתמש בהן לבחירה לאחר שינוי עם פפטידים דביקים של תאים או גורמים ביו-אקטיביים אחרים. תאי פיברובלסטים מתחברים, מתפשטים ומתרבים כאשר הם מתרבים בתוך הפיגומים התלת-ממדיים, גדלים לראשונה על פני המיקרוג’ל וממלאים את רוב המקרופורים לאחר 5 ימים. מחקר ראשוני בתרבית משותפת של פיברובלסטים אנושיים ותאי אנדותל של ורידים בטבור אנושי (HUVECs) הראה תוצאות מבטיחות להיווצרות מבנים דמויי כלי דם בתוך הפיגומים התלת-ממדייםהמקושרים 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
אחד השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הוא האיכות של 2-אמינואתיל מתקרילט (AMA) המשמש כקומונומר לתפקוד אמין ראשוני. ה-AMA צריכה להיות אבקה עדינה ועדיף חסרת צבע המועברת במיכל זכוכית חום אטום לגז. יש להימנע משימוש בחומר ירקרק וגבשושי, שכן הוא פוגע באופן משמעותי בתגובת הג’לציה ומשפיע לרעה על יכולת השחזו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מביעים את תודתנו למחברים השותפים של עבודתנו הקודמת שמתודולוגיה זו מבוססת עליהם, סלין ממזר, לואיס פ. ב. גרזוני, יונקה קיטל, רוסטיסלב וינוקור, ניקולאי בורן ותמאס הרסטי. אנו מודים על מימון מ- Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) במסגרת הפרויקט B5 ו- C3 SFB 985 “מיקרוג’לים פונקציונליים ומערכות מיקרוג’ל”. אנו מכירים במימון מוועדת התחרות של הסנאט של לייבניץ (SAW) במסגרת תוכנית Professorinnenprogram (SAW-2017-PB62: BioMat). אנו מכירים בכנות במימון מהנציבות האירופית (EUSMI, 731019). עבודה זו בוצעה בחלקה במרכז לטכנולוגיית פולימרים כימיים (CPT), אשר נתמך על ידי האיחוד האירופי והמדינה הפדרלית של נורדריין-וסטפאליה (מענק EFRE 30 00 883 02).
Materials
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Hsu, R. -. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Chen, Z., et al. Advanced microfluidic devices for fabricating multi-structural hydrogel microsphere. Exploration. 1 (3), 20210036 (2021).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Guerzoni, L. P. B., et al. Cell encapsulation in soft, anisometric poly(ethylene) glycol microgels using a novel radical-free microfluidic system. Small. 15 (20), 1900692 (2019).
- Krüger, A. J. D., et al. Compartmentalized jet polymerization as a high-resolution process to continuously produce anisometric microgel rods with adjustable size and stiffness. Advanced Materials. 31 (49), 1903668 (2019).
- Darling, N. J., et al. Click by click microporous annealed particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Lutzweiler, G., Ndreu Halili, ., Engin Vrana, N. The overview of porous, bioactive scaffolds as instructive biomaterials for tissue regeneration and their clinical translation. Pharmaceutics. 12 (7), 602 (2020).
- Dang, H. P., et al. 3D printed dual macro-, microscale porous network as a tissue engineering scaffold with drug delivering function. Biofabrication. 11 (3), 035014 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
