COVID-19 관련 중이 병리학 평가를위한 고속 인간 측두골 절편
Summary
이 기사에서는 트윈 다이아몬드 블레이드가있는 마이크로 소를 사용하여 측두골 면역 조직 화학의 신속한 탈석회화 및 분석을 위해 얇은 조각을 생성하는 신속한 인간 측두골 절편 기술을 설명합니다.
Abstract
인간의 측두골 절편의 조직병리학적 분석은 내이 및 중이 병리학을 연구하기 위한 근본적인 기술이다. 측두골 절편은 사후 측두골 수확, 고정, 탈석회화, 임베딩 및 염색에 의해 준비됩니다. 측두골의 밀도로 인해 탈석회화는 시간이 많이 걸리고 자원 집약적 인 과정입니다. 완전한 조직 준비는 평균 9-10 개월이 걸릴 수 있습니다. 이것은 이비병리학 연구를 늦추고 COVID-19 전염병과 관련된 연구와 같이 시간에 민감한 연구를 방해합니다. 이 논문은 조직 처리 속도를 높이기 위해 측두골 절편의 신속한 준비 및 탈석회화 기술을 설명합니다.
측두골은 표준 기술을 사용하여 사후 수확하고 10% 포르말린으로 고정하였다. 트윈 다이아몬드 블레이드가 달린 정밀 마이크로 톱을 사용하여 각 섹션을 세 개의 두꺼운 섹션으로 절단했습니다. 두꺼운 측두골 절편을 파라핀에 매립하기 전에 7-10일 동안 탈석회화 용액에서 탈석회시키고, 냉동고를 사용하여 얇은 (10 μm) 절편으로 절편화하고, 충전되지 않은 슬라이드에 장착하였다. 이어서, 조직 샘플을 탈파라핀화하고 항체 염색 (ACE2, TMPRSS2, Furin)을 위해 재수화시키고, 이미지화하였다. 이 기술은 수확에서 조직 분석까지의 시간을 9-10 개월에서 10-14 일로 단축했습니다. 고속 측두골 절제술은 이비병리학 연구의 속도를 높이고 조직 준비에 필요한 자원을 줄이는 동시에 COVID-19와 관련된 것과 같은 시간에 민감한 연구를 촉진 할 수 있습니다.
Introduction
인간의 측두골 연구는 내이와 중이의 병리학 및 병리 생리학을 연구하는 데 귀중한 자원을 제공합니다. 19세기 이전에는 이비인후과 질환 1,2,3에 대해 알려진 바가 거의 없었다. 이비인후과 질환을 더 잘 이해하고 “돌팔이의 손에서 청각 수술을 구하기”위해 Joseph Toynbee (1815-1866)는 인간 측두골의 조직 학적 섹션을 연구하는 방법을 개발했습니다3. 이 연구는 19 세기의 나머지 기간 동안 비엔나와 유럽 전역의 Adam Politzer (1835-1920)에 의해 촉진되었으며, 그는 측두골 섹션을 사용하여 귀 2,3,4에 영향을 미치는 많은 일반적인 조건의 조직 병리학을 설명했습니다.
미국 최초의 인간 측두골 실험실은 1927 년 존스 홉킨스 병원 (Johns Hopkins Hospital)에 문을 열었으며, 스테이시 길드 (Stacy Guild, 1890-1966)는 측두골 절편 5,6 방법을 개발했습니다. 길드가 개발 한 방법은 사후 수확, 고정, 질산에서의 탈석회화, 에탄올에서의 탈수, 셀로이드 임베딩, 절개, 염색 및 장착을 포함하는 9-10 개월 과정으로 구성되었습니다. 이 기술에 대한 수정은 나중에 Harold Schuknecht (1917-1996)7에 의해 이루어졌습니다. 그러나이 프로세스의 기본 구성 요소는 본질적으로 변경되지 않습니다.
측두골 실험실을 유지하는 데 필요한 중요한 자원은 측두골 연구에 대한 도전을 제시했으며 지난 30 년 동안 4,8 년 동안 인기가 감소하는 데 기여했을 가능성이 큽니다. 측두골 실험실 자원의 상당 부분은 측두골 준비의 9-10 개월 과정에 전념해야합니다. 준비에서 가장 시간이 많이 걸리는 단계 중 하나는 인체에서 가장 밀도가 높은 뼈 인 측두골의 탈석회화입니다. 탈석회화는 일반적으로 질산 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)에서 수행되며 용액 7,9를 자주 교체해야 하는 동안 몇 주에서 몇 달이 걸립니다. 또한, COVID-19 전염병과 관련된 것과 같이 인간의 귀에 대한 시간에 민감한 연구는 이러한 느린 준비 과정에 의해 방해받을 수 있습니다. 이 논문은 다이아몬드 마이크로 톱을 사용하여 측두골 수확 후 10-14 일 이내에 신속한 탈석회화 및 조직 분석을 가능하게하는 두꺼운 섹션을 생성하는 고속 측두골 절편화 기술을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간의 측두골 연구는 내과 중이 병리학을 연구하는 데 중요하지만 시간과 자원 집약적 인 노력으로 남아 있습니다. 이 논문은 다이아몬드 마이크로 톱을 사용하여 추가 절편화 전에 신속하게 탈석회화 할 수있는 두꺼운 측두골 절편을 생성하여 조직 수확에서 연구까지의 시간을 9-10 개월에서 10-14 일로 단축 할 수있는 기술을 설명합니다. 이 기술은 측두골 처리에 필요한 자원을 줄이고 COVID-19 중…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트에 도움을 주신 모하메드 리하르에게 감사드립니다. 이 연구는 부분적으로 국립 보건원 (T32DC000027, NSA)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet – 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
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