Høyhastighets human temporal beinseksjon for vurdering av COVID-19-assosiert mellomørepatologi
Summary
Denne artikkelen beskriver en teknikk for rask menneskelig temporal beinseksjonering som benytter en mikrosag med tvillingdiamantblader for å generere tynne skiver for rask avkalkning og analyse av temporal beinimmunhistokjemi.
Abstract
Histopatologisk analyse av menneskelige temporale beinseksjoner er en grunnleggende teknikk for å studere indre og mellomørepatologi. Temporale beinseksjoner fremstilles ved postmortem temporal beinhøsting, fiksering, avkalkning, innebygging og farging. På grunn av tettheten av tinningbenet er avkalkning en tidkrevende og ressurskrevende prosess; fullstendig vevsforberedelse kan ta 9-10 måneder i gjennomsnitt. Dette bremser otopatologiforskning og hindrer tidssensitive studier, som de som er relevante for COVID-19-pandemien. Dette papiret beskriver en teknikk for rask forberedelse og avkalkning av temporale beinseksjoner for å øke hastigheten på vevsbehandling.
Temporale bein ble høstet postmortem ved hjelp av standardteknikker og festet i 10% formalin. En presisjonsmikrosag med doble diamantblader ble brukt til å kutte hver seksjon i tre tykke seksjoner. Tykke tinningbeinseksjoner ble deretter avkalket i avkalkningsoppløsning i 7-10 dager før de ble innebygd i parafin, seksjonert i tynne (10 μm) seksjoner ved hjelp av et kryotom og montert på uladede lysbilder. Vevsprøver ble deretter deparaffinisert og rehydrert for antistofffarging (ACE2, TMPRSS2, Furin) og avbildet. Denne teknikken reduserte tiden fra høsting til vevsanalyse fra 9-10 måneder til 10-14 dager. Høyhastighets temporal beinseksjonering kan øke hastigheten på otopatologiforskning og redusere ressursene som er nødvendige for vevsforberedelse, samtidig som det letter tidsfølsomme studier som de som er relatert til COVID-19.
Introduction
Menneskelig temporal beinforskning gir en uvurderlig ressurs for å studere patologien og patofysiologien til det indre og mellomøret. Før det 19. århundre var lite kjent om otologisk sykdom 1,2,3. For bedre å forstå otologisk sykdom og “redde lydkirurgi fra kvakksalverens hender”, utviklet Joseph Toynbee (1815-1866) metoder for å studere histologiske deler av det menneskelige tinningbenet3. Dette arbeidet ble fremmet av Adam Politzer (1835-1920) i Wien og andre over hele Europa i løpet av resten av det 19. århundre, som brukte temporale beinseksjoner for å beskrive histopatologien til mange vanlige forhold som påvirker øret 2,3,4.
Det første menneskelige temporale beinlaboratoriet i USA ble åpnet i 1927 på Johns Hopkins Hospital, hvor Stacy Guild (1890-1966) utviklet metoder for temporal beinseksjonering 5,6. Metodene utviklet av Guild besto av en 9-10 måneders prosess som inkluderte postmortem høsting, fiksering, avkalkning i salpetersyre, dehydrering i etanol, celloidininnbygging, seksjonering, farging og montering. Modifikasjoner av denne teknikken ble senere gjort av Harold Schuknecht (1917-1996)7; Imidlertid forblir de grunnleggende komponentene i denne prosessen i det vesentlige uendret.
De betydelige ressursene som kreves for å opprettholde et temporalt beinlaboratorium har presentert en utfordring for temporal beinforskning og sannsynligvis bidratt til dens fallende popularitet de siste 30 årene 4,8. En betydelig del av temporal bein laboratorieressurser må være viet til 9-10 måneders prosess med temporal bein forberedelse. En av de mest tidkrevende trinnene i forberedelsen er avkalkning av tinningbenet, som er det tetteste beinet i menneskekroppen. Avkalkning utføres vanligvis i salpetersyre eller etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og tar uker til måneder mens det krever hyppig endring av løsninger 7,9. Videre kan tidsfølsomme studier av det menneskelige øre, som de som er relatert til COVID-19-pandemien, bli hindret av denne langsomme forberedelsesprosessen. Dette papiret beskriver en teknikk for høyhastighets temporal beinseksjonering som bruker en diamantmikrosag for å generere tykke seksjoner som muliggjør rask avkalkning og vevsanalyse innen 10-14 dager etter temporal beinhøsting.
Protocol
Representative Results
Discussion
Menneskelig temporal beinforskning er kritisk for å studere indre og mellomørepatologi, men er fortsatt en tids- og ressurskrevende innsats. Dette papiret beskriver en teknikk som bruker en diamantmikrosag for å generere tykke temporale beinseksjoner som raskt kan avkalkes før videre snitting, slik at tiden fra vevshøst til studie kan reduseres fra 9-10 måneder til 10-14 dager. Denne teknikken kan redusere ressursene som kreves for temporal beinbehandling og legge til rette for tidsfølsomme studier, for eksempel d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Mohamed Lehar for hans hjelp med dette prosjektet. Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health (T32DC000027, NSA).
Materials
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet – 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
- Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
- Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).
- Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
- Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
- Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480 (1934).
- Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
- Schuknecht, H. . Pathology of the Ear. , (1993).
- Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science–and art–of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
- Nager, G. T. . Pathology of the Ear and Temporal Bone. , (1993).
- . COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE) Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022)
- Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822 (2022).
- Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
- Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology – Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
- Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
- Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113 (2021).
- McCall, A. A., et al. Extralabyrinthine manifestations of DFNA9. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).
- Wu, P. Z., O’Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
- Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
- Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).
