CAM-Delam-analysen til evaluering af kræftcellernes metastatiske kapacitet er relativt hurtig, nem og billig. Metoden kan bruges til at optrævle de molekylære mekanismer, der regulerer metastasedannelse og til lægemiddelscreening. Et optimeret assay til analyse af humane tumorprøver kan være en klinisk metode til personlig kræftbehandling.
Hovedårsagen til kræftrelaterede dødsfald er metastasedannelse (dvs. når kræftceller spredes fra den primære tumor til fjerne organer og danner sekundære tumorer). Delaminering, defineret som nedbrydning af basal lamina og kældermembran, er den indledende proces, der letter transmigration og spredning af kræftceller til andre væv og organer. Scoring af kræftcellernes delamineringskapacitet ville indikere disse cellers metastatiske potentiale.
Vi har udviklet en standardiseret metode, ex ovo CAM-Delam assayet, til at visualisere og kvantificere kræftcellers evne til at delaminere og invadere og derved kunne vurdere metastatisk aggressivitet. Kort fortalt omfatter CAM-Delam-metoden såning af kræftceller i silikoneringe på chick chorioallantoic membrane (CAM) på embryonal dag 10 efterfulgt af inkubation fra timer til et par dage. CAM-Delam-analysen omfatter brugen af et internt befugtet kammer under inkubation af kyllingembryoner. Denne nye tilgang øgede embryooverlevelsen fra 10%-50% til 80%-90%, hvilket løste tidligere tekniske problemer med lave embryooverlevelsesrater i forskellige CAM-assays.
Dernæst blev CAM-prøverne med tilhørende kræftcelleklynger isoleret, fikseret og frosset. Endelig blev kryostatsektionerede prøver visualiseret og analyseret for kældermembranskader og kræftcelleinvasion ved hjælp af immunhistokemi. Ved at evaluere forskellige kendte metastatiske og ikke-metastatiske kræftcellelinjer designet til at udtrykke grønt fluorescerende protein (GFP) viste CAM-Delam kvantitative resultater, at delamineringskapacitetsmønstrene afspejler metastatisk aggressivitet og kan scores i fire kategorier. Fremtidig brug af dette assay, bortset fra at kvantificere delamineringskapacitet som en indikation af metastatisk aggressivitet, er at optrævle de molekylære mekanismer, der styrer delaminering, invasion, dannelse af mikrometastaser og ændringer i tumormikromiljøet.
Ca. 90% af dødeligheden hos kræftpatienter skyldes konsekvenserne af kræftmetastase, som er dannelsen af sekundære tumorer i andre dele af kroppen, hvorfra kræften oprindeligt stammer1. Det er derfor vigtigt at identificere metastatiske relaterede mekanismer til at finde potentielle mål for at undertrykke dannelsen af tumormetastaser. Efterfølgende er der behov for modelsystemer, hvor den metastatiske proces kan evalueres.
Under metastase gennemgår kræftceller epitel-til-mesenkymal overgang (EMT), en normal cellulær proces, hvor epitelceller mister deres vedhæftnings- og polaritetsegenskaber og i stedet erhverver en invasiv mesenkymal karakter2. Delaminering er en del af EMT-processen og involverer nedbrydning af laminin i kældermembranen, hvilket er en forudsætning for, at kræftceller kan forlade den primære tumor og invadere andre væv. De vigtigste faktorer, der opreguleres under metastasedannelse, omfatter matrixmetalloproteinaser (MMP’er), ADAM (en disintergin og metalloproteinase), ADAMTS (ADAM med trombospondinmotiver) og membran-type MMP’er (MMP’er)3,4. Disse faktorer nedbryder molekyler som laminin, som udtrykkes i alle kældermembraner, for at lette cellemigration og invasion.
Den chorioallantoiske membran (CAM) af et befrugtet kyllingæg er en type kældermembran. Befrugtede kyllingæg er blevet anvendt som metastatiske modeller, hvor kræftceller er blevet podet på den ekstraembryonale CAM og senere metastasedannelse observeret i kyllingeembryonerne5. Desuden anvendes in vivo-musens metastatiske modeller ofte, hvor kræftceller implanteres i musene, og metastaser i forskellige organer analyseres6. Denne tilgang er tidskrævende, dyr og kan forårsage ubehag for dyrene. For at løse dette har vi udviklet CAM-Delam-analysen, en hurtigere og billigere model til evaluering af kræftcellers metastatiske aggressivitet. I denne model kombineres kræftcellernes evne til at nedbryde chick CAM (f.eks. Delamineringskapaciteten) med potentiel kræftcelleinvasion i mesenchymet og anvendes som en måling af metastatisk aggressivitet.
Denne artikel,der er baseret på en tidligere publikation 7, beskriver CAM-Delam-analysen i detaljer, fra befrugtet chick egg-håndtering, kræftcellekultur og såning, dissektion og analyser af CAM-prøver til scoring af kræftcellernes delamineringskapacitet i fire kategorier: intakt, ændret, beskadiget og invasion. Vi giver også eksempler på, hvordan dette assay kan bruges til at bestemme de molekylære mekanismer, der regulerer delamineringsprocessen.
Dette papir beskriver CAM-Delam-analysen for at evaluere kræftcellernes metastatiske aggressivitet, bestemt ved at score basale laminamoduleringer og potentiel celleinvasion i mesenchymet inden for en periode på timer til et par dage. Et tidligere teknisk problem for forskellige CAM-assays har været den lave overlevelse af kyllingembryoner. Dette problem blev løst ved at indføre brugen af et internt befugtet kammer under embryoinkubation, hvilket øgede embryooverlevelsen fra 10% -50% til 80% -90%7. Anvendelsen af et internt befugtet kammer kan derfor være værdifuldt i CAM-assays generelt såvel som i andre ex ovo chick-eksperimenter.
De præsenterede scoringstidspunkter på 14 timer, 1,5 dage, 2,5 dage og 3,5 dage efter såning af 1 x 106 kræftceller på CAM er baseret på streng metodeudvikling ved hjælp af seks forskellige kræftcellelinjer og er tilstrækkelige til at skelne mellem området fra ikke-delaminerende til delaminerende-med-invasionskapacitet af kræftcellelinjer. Der foreslås en minimumsanvendelse af fire æg med tre ringe i hver pr. tidspunkt og pr. cellelinje, og dette bør gentages mindst én gang eller i henhold til forsøgsdesign og statistiske krav. En fordel ved CAM-Delam-analysen er at opnå informative resultater vedrørende kræftcellernes delamineringskapacitet inden for få dage for at estimere kræftcellernes aggressivitet og potentiel risiko for metastasedannelse. Den hurtige levering af resultater lettes ved at overvåge nedbrydningen af basal lamina på grund af de invaderende kræftceller og de efterfølgende mikrotumorer / tumorknopper og organmetastaser. Traditionelt er CAM-modeller blevet brugt til at analysere dannelsen af organmetastaser, hvilket tager omkring 2 uger at blive bestemt9. Ved at bruge syv forskellige kræftcellelinjer har vi tidligere verificeret7, at delamineringsscoringsscoren er knyttet til kræftcellernes evne til at danne metastaser i gnavermodeller 10,11,12,13,14, hvilket understøtter den prædiktive værdi af CAM-Delam-analysen. Desuden kræver musemodeller endnu længere tid, flere uger op til måneder, før metastaser kan undersøges15,16. Kort fortalt er dette udviklede CAM-Delam-assay, der fokuserer på at score delamineringskapacitet og ikke på at undersøge senere tumordannelse i kyllingeembryoet, derfor et godt supplement til eksisterende kylling CAM invasion og musetumormodeller.
En begrænsning i CAM-Delam-analysen kan være den uklare visualisering af basal lamina, hvis kræftcellerne selv udtrykker laminin. I så fald kan andre markører, der angiver basal lamina, såsom E-cadherin, anvendes7. Andre CAM invasion undersøgelser har brugt type IV kollagen til at visualisere CAM og pan-cytokeratin og vimentin til at identificere invaderende kræftceller og dannelsen af mikrotumorer / tumorknopper 17,18.
Delaminering er en normal cellulær proces, både under udvikling og senere i livet, hvilket gør det muligt for celler at forlade et epitel og migrere til andre væv. Eksempler på delaminerende celler under udvikling er neurale kam og olfaktoriske banebrydende neuroner19,20; senere i livet er sårheling afhængig af delaminering21. Under kræft opreguleres denne proces i de forkerte celler og / eller på det forkerte tidspunkt. CAM-Delam-metoden kan således være til nytte til at optrævle de molekylære mekanismer, der regulerer delaminering, hvilket ville være af betydning for både grundlæggende biologisk og sygdomskendskab. Sådanne delamineringsundersøgelser vil omfatte tilføjelse af faktorer af interesse for de kræftceller, der er podet på CAM, eller undersøgelse af genetisk modificerede kræftceller. Et eksempel, der præsenteres her, er CoCl 2-forbehandling af den ikke-metastatiske cellelinje U251 for at inducere hypoxi, hvilket fører til induktion af en metastatisk aggressiv kapacitet, der kan undertrykkes af en bredspektret MMP-hæmmer. At finde nøglemolekyler, der styrer delaminering, øger således muligheden for at designe hæmmere til at undertrykke denne proces. I forhold til dette er en anden potentiel anvendelse af CAM-Delam-protokollen i lægemiddelscreening til undertrykkelse af delaminering og celleinvasion. Desuden er evalueringen af kræftens sværhedsgrad i klinikken en kritisk komponent til diagnose, planlægning af behandling og pleje. I øjeblikket er TNM-iscenesættelsessystemet (T, tumorstørrelse; N, knude-om kræften har spredt sig til lymfeknuderne; M, fjern metastase) bruges til at evaluere sværhedsgraden af kræften22. CAM-Delam-analysen definerer en innovativ tilgang til evaluering af kræftcellernes aggressivitet og potentielle risiko for dannelse af metastaser og kan være et nyttigt supplement til TNM-iscenesættelsessystemet. Bemærkelsesværdigt er, at TNM-iscenesættelse er baseret på analyser af faste vævsprøver, mens en potentiel klinisk CAM-Delam-tilgang ville undersøge frisk eller friskfrosset væv i kombination med teknikker til genoplivning af frosne celler23.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker følgende forskere ved Umeå Universitet for deres hjælp med relevante kræftcellelinjer og antistoffer: L. Carlsson (von Willebrand Factor antistof), J. Gilthorpe (U251) og M. Landström (PC-3U). Vi takker også Hauke Holthusen i Gilthorpe-laboratoriet for genereringen af HEK293-TLR-AAVS1 stabile cellelinje. Arbejdet i Gunhaga-laboratoriet blev støttet af den svenske kræftfond (18 0463), Umeå Biotech Incubator, Norrlands Cancerforskningsfond, det svenske forskningsråd (2017-01430) og det medicinske fakultet ved Umeå Universitet.
EQUIPMENT | |||
Centrifuge | Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen | ||
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
Cryostat | HM 505 E, Microm | ||
Digital camera | Nikon DS-Ri1 | ||
Dissection Microscope | Leica M10 | For CAM-sample dissection and positioning in molds | |
Egg incubator | Fiem | Many other sources are available. Must be cleaned and sterilized with 70 % ethanol before each use | |
Epifluorescence microscope | Nikon Eclipse, E800 | Equiped with a digital camera, for scoring delamination and cell invasion. | |
Fine forceps | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
Freezer -80 °C | Thermo Fisher Scientific | 8600 Series | Model 817CV |
Inverted microscope | Nikon Eclipse TS100 | For cell culture work | |
Scissors (small) | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
MATERIALS | |||
anti-Laminin-111 | Sigma-Aldrich | L9393 | Primary anti-rabbit antibody (1:400) |
anti-rabbit Cy3 | Jackson Immuno Research | 111-165-003 | Secondary antibody (1:400) |
anti-von Willebrand Factor | DAKO | P0226 | Primary antibody (1:100) |
Cobalt(II) chloride |
Sigma-Aldrich | 232696-5G | CAUTION: moderate toxicity chemical. Handle with care only in fume hood. Follow manufacturers instructions |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (1:400) |
Fertilized chicken eggs | Strömbäcks Ägg, Vännäs, Sweden | Any local egg supplyer | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10500-064 | |
Fluorescence mounting medium | Allent Technologie | S302380-2 | Avoid bubble formation when mounting. Allow to dry at +4 °C |
Glass chambers for silicon rings | Many sources are available | We used 15 mL glass chambers. Around 20 silicon rings fit in one chamber. Avoid crowding, since the rings may stick together and aggravate work. | |
Glass coverslips | VWR International | 631-0165 | |
GM6001 MMP Inhibitor | Sigma-Aldrich | CC1010 | |
Microscope slides for immunohistochemistry | Fisher Scientific | 10149870 | |
NEG-50 frozen medium | Cellab | 6506 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | CAUTION: highly toxic. Handle with care only in fume hood, follow manufacturers instructions. Use all protective clothing. |
Peel-A-Way Embedding Molds |
Polysciences | 18985 | |
Penicillin–streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Petri dishes | Sarstedt | 83.3903 | 15 cm in diameter for cell culture |
Plastic box | Esclain | ||
PureCol EZ Gel Collagen | Cellsystems | 5074-35ML | 5 mg/mL. Gelatinous material. Pipette very slowly and carefully to avoid cells being lost in the bubble formations. |
RPMI medium | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | |
Silicon rings | VWR International | 228-1580 | Inner/outer diameter: 4/5 mm. Should be sterilized before use. Avoid repeated autoclaving of unused rings. |
Trypan blue | Fisher Scientific | T10282 | |
Trypsin | Life Technologi | 15400054 | 0.50% |
Weighing boats | VWR International | 611-0094 | |
SOLUTIONS | |||
Collagen-RPMI media mixture (1 mL) | Compelete RPMI Media 750 µL |
||
PureCol EZ Gel Collagen 250 µL |
|||
Mix and use immediately | |||
Complete RPMI media (500 mL) | RPMI Media 445 mL |
||
FBS 50 mL |
|||
Penicillin–streptomycin 5mL |
|||
Store at 4 °C | |||
PB (0.2 M; 1 000 mL) | Na2HPO4 (MW 141.76) 21.9 g |
||
NaH2PO4 (MW 137.99) 6.4 g |
|||
add deionized water up to final volume of 1000ml | |||
Store in RT | |||
PFA (4 %) in 0.1 M PB (100 mL) | Deionized water 50 mL |
||
0.2 M PB 50 mL |
|||
Paraformaldehyde (PFA) 4g |
|||
heat to 60 °C in water bath | |||
add 5 M NaOH 25 µL |
|||
Stir to dissolve the PFA powder | |||
Store at 4 °C | |||
TBST (1 000 mL) | 50mM Tris pH 7,4 50 mL |
||
150mM NaCI 30 mL |
|||
0,1% Triton X-100 10 mL |
|||
H2O (MQ) 900 mL |
|||
Trypsin (0.05 %; 10 mL) | 1x PBS 9 mL |
||
10x Trypsin (0.5 %) 1 mL |
|||
10 mL in total, Store at 4 °C |