In vitro Reconstitución del citoesqueleto de actina dentro de vesículas unilamelares gigantes

Summary

En este manuscrito, demostramos las técnicas experimentales para encapsular el citoesqueleto de actina F en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (también llamadas liposomas), y el método para formar una capa de actina F que imita la corteza en la valva interna de la membrana liposómica.

Abstract

El citoesqueleto de actina, la principal maquinaria mecánica en la célula, media numerosas actividades celulares físicas esenciales, incluyendo la deformación, división, migración y adhesión celular. Sin embargo, el estudio de la dinámica y la estructura de la red de actina in vivo se complica por la regulación bioquímica y genética dentro de las células vivas. Para construir un modelo mínimo desprovisto de regulación bioquímica intracelular, la actina se encapsula dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUV, también llamadas liposomas). Los liposomas biomiméticos son del tamaño de una célula y facilitan una visión cuantitativa de las propiedades mecánicas y dinámicas de la red del citoesqueleto, abriendo una ruta viable para la biología sintética ascendente. Para generar liposomas para encapsulación, se utiliza el método de emulsión invertida (también conocido como método de transferencia de emulsión), que es una de las técnicas más exitosas para encapsular soluciones complejas en liposomas para preparar varios sistemas que imitan células. Con este método, se agrega una mezcla de proteínas de interés al tampón interno, que luego se emulsiona en una solución de aceite mineral que contiene fosfolípidos para formar gotas de lípidos monocapa. Los liposomas deseados se generan a partir de gotas lipídicas monocapa que cruzan una interfaz lípido/aceite-agua. Este método permite la encapsulación de polímeros de actina concentrados en los liposomas con los componentes lipídicos deseados, allanando el camino para la reconstitución in vitro de una red de citoesqueleto bioimitador.

Introduction

El citoesqueleto de actina juega un papel fundamental en la construcción de la arquitectura intracelular de la célula mediante la coordinación de la contractilidad a nivel molecular y la generación de fuerza ^1,2,3. Como resultado, media numerosas actividades celulares esenciales, incluyendo la deformación celular^4,5, división⁶, migración ^7,8 y adhesión⁹. La reconstitución in vitro de las redes de actina ha ganado una gran atención en los últimos años 10,11,12,13,14,15,16,17. El objetivo de la reconstitución es construir un modelo mínimo de la célula desprovisto de la compleja regulación bioquímica que existe dentro de las células vivas. Esto ofrece un ambiente controlable para sondear actividades intracelulares específicas y facilita la identificación y análisis de diferentes componentes del citoesqueleto de actina^18,19. Además, la encapsulación de las redes de actina in vitro dentro de las vesículas unilamelares gigantes de fosfolípidos (GUV, liposomas) proporciona un espacio confinado pero deformable con un límite semipermeable. Imita el microambiente fisiológico y mecánico de la maquinaria de actina dentro de la célula 9,20,21,22.

Entre los diversos métodos para preparar liposomas, el método de hidratación de la película lipídica (también conocido como método de hinchazón) es una de las primeras técnicas²³. La película lipídica seca hidrata con la adición de tampones, formando burbujas membranosas que eventualmente se convierten en vesículas²⁴. Para producir vesículas más grandes con un mayor rendimiento, un método mejorado que avanza desde el método de hidratación de la película, conocido como el método de electroformación²⁵, aplica un campo eléctrico de CA para promover eficientemente el proceso de hidratación²⁶. Las principales limitaciones de estos métodos basados en la hidratación para la encapsulación de actina son que tiene una baja eficiencia de encapsulación de proteínas altamente concentradas, y sólo es compatible con composiciones lipídicas específicas²⁴. La técnica de emulsión invertida, en comparación, tiene menos limitaciones para los componentes lipídicos y las concentraciones de proteínas^20,27,28,29. En este método, se agrega una mezcla de proteínas para la encapsulación al tampón acuoso interno, que luego se emulsiona en una solución de aceite mineral que contiene lípidos, formando gotitas de monocapa lipídica. Las gotas lipídicas monocapa luego cruzan a través de otra interfaz lípido/aceite-agua a través de la centrifugación para formar vesículas lipídicas bicapa (liposomas). Esta técnica ha demostrado ser una de las estrategias más exitosas para la encapsulación de actina^24,30. Por separado, hay algunos métodos de dispositivos microfluídicos, incluyendo el chorro pulsado 31,32^, la eyección transitoria de membrana³³ y el método cDICE³⁴. Las similitudes entre el método de emulsión invertida y el método microfluídico son el disolvente lipídico (aceite) que se utiliza y la introducción de la interfaz lípido/aceite-agua para la formación de la valva externa de los liposomas. Por el contrario, la generación de liposomas por el método microfluídico requiere una configuración de dispositivos microfluídicos y se acompaña de aceite atrapado entre las dos valvas de la bicapa, lo que requiere un paso adicional para la eliminación del aceite³⁵.

En este manuscrito, utilizamos la técnica de emulsión invertida para preparar liposomas encapsulando una red de actina F polimerizada como se usó anteriormente²². La mezcla de proteínas para la encapsulación se colocó primero en un tampón con condiciones no polimerizantes para mantener la actina en su forma globular (G). Todo el proceso se llevó a cabo a 4 °C para evitar la polimerización temprana de actina, que luego se desencadenó al permitir que la muestra se calentara a temperatura ambiente. Una vez a temperatura ambiente, la actina polimeriza en su forma filamentosa (F). Se puede agregar una variedad de proteínas de unión a actina a la solución tampón acuosa interna para estudiar las funcionalidades y propiedades de las proteínas, lo que proporciona información adicional sobre su interacción con la red de actina y la superficie de la membrana. Este método también se puede aplicar a la encapsulación de diversas proteínas de interés³⁶ y objetos grandes (micropartículas, micronadadores autopropulsados, etc.) cercanos al tamaño de los liposomas finales ^28,37.

Protocol

1. Preparación de tampones y soluciones proteicas Prepare el tampón acuoso de no polimerización interna (INP) en un volumen total de 5 mL mezclando 0.1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco, 320 mM sacarosa y0.2 mM ATP. Prepare la mezcla de proteínas (PM) agregando proteínas al tampón INP a 4 °C con las siguientes concentraciones: 11.2 μM de actina G no fluorescente, actina marcada fluorescente de 2.8 μM y Arp2/3 de 0.24 μM (Tabla de mate…

Representative Results

La preparación de liposomas basada en la técnica de emulsión invertida se ilustra gráfica y esquemáticamente en la Figura 1. Primero, se prepararon liposomas vacíos (desnudos) (~ 5-50 μm de diámetro) que estaban compuestos de fosfolípidos (EPC) y lípidos fluorescentes (DHPE). Un tinte fluorescente brillante de color rojo lejano se encapsuló dentro de liposomas desnudos como un experimento de control. Si una monocapa lipídica se ha formado con éxito en…

Discussion

Varios pasos clave determinan el éxito de un alto rendimiento de liposomas durante el proceso de preparación. Para disolver completamente la película lipídica en el aceite, la muestra debe ser sonicada hasta que la película lipídica en el fondo del vial de vidrio desaparezca por completo. Después de la sonicación, la mezcla de lípidos y aceite debe almacenarse durante la noche a temperatura ambiente en condiciones oscuras para que las moléculas lipídicas se dispersen más²⁹. La mezcla p…

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)	Avanti Polar Lipids Inc.	231615773	Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane	Sigma	D27802-25G	DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton, Inc	AKL99-D	non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton, Inc	AR05	fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma	A2383-10G	ATP
Alexa Fluor 647 dye	ThermoFisher		fluorescent dye
Andor iQ3	Andor Technologies		control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain	Cytoskeleton, Inc	RP01P-A	Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate	Sigma	10035048	CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)	Quorum Technologies		incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant	Cytoskeleton, Inc	CF01-C	cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective)	Andor Technologies	LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA	Sigma	G7528	glucose
Dithiothreitol	DOT Scientific	DSD11000-10	DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant	Cytoskeleton, Inc	HPG6	gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip	Cole-Parmer	UX-07940-53	glass syringe
HEPES	AmericanBio	7365-45-9
ImageJ/Fiji			https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine	Avanti Polar Lipids Inc.	97281442	EPC
Magnesium chloride	Sigma	7786303	MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil	Sigma	8042475	mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His)			VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)	Thermo Fisher	O12650	DHPE
Potassium chloride	Sigma	7447407	KCl
Sucrose	Sigma	57-50-1	sucrose
β-Casein from bovine milk	Sigma	C6905-250MG