In vitro Reconstitution du cytosquelette d’actine à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes

Summary

Dans ce manuscrit, nous démontrons les techniques expérimentales pour encapsuler le cytosquelette F-actine dans des vésicules lipidiques unilamellaires géantes (également appelées liposomes), et la méthode pour former une couche de F-actine biomitant le cortex au niveau du feuillet interne de la membrane liposomique.

Abstract

Le cytosquelette d’actine, la principale machinerie mécanique de la cellule, intervient dans de nombreuses activités cellulaires physiques essentielles, notamment la déformation, la division, la migration et l’adhésion cellulaires. Cependant, l’étude de la dynamique et de la structure du réseau d’actine in vivo est compliquée par la régulation biochimique et génétique au sein des cellules vivantes. Pour construire un modèle minimal dépourvu de régulation biochimique intracellulaire, l’actine est encapsulée dans des vésicules unilamellaires géantes (GUV, également appelées liposomes). Les liposomes biomimétiques sont de la taille d’une cellule et facilitent un aperçu quantitatif des propriétés mécaniques et dynamiques du réseau de cytosquelettes, ouvrant une voie viable pour la biologie synthétique ascendante. Pour générer des liposomes pour l’encapsulation, la méthode d’émulsion inversée (également appelée méthode de transfert d’émulsion) est utilisée, qui est l’une des techniques les plus efficaces pour encapsuler des solutions complexes dans des liposomes afin de préparer divers systèmes imitant les cellules. Avec cette méthode, un mélange de protéines d’intérêt est ajouté au tampon interne, qui est ensuite émulsionné dans une solution d’huile minérale contenant des phospholipides pour former des gouttelettes lipidiques monocouches. Les liposomes souhaités sont générés à partir de gouttelettes lipidiques monocouches traversant une interface lipide/huile-eau. Cette méthode permet l’encapsulation de polymères d’actine concentrés dans les liposomes avec les composants lipidiques souhaités, ouvrant la voie à la reconstitution in vitro d’un réseau de cytosquelettes biomimiques.

Introduction

Le cytosquelette d’actine joue un rôle fondamental dans la construction de l’architecture intracellulaire de la cellule en coordonnant la contractilité au niveau moléculaire et la génération de force ^1,2,3. En conséquence, il intervient dans de nombreuses activités cellulaires essentielles, notamment la déformation cellulaire^4,5, la division⁶, la migration ^7,8 et l’adhésion⁹. La reconstitution in vitro des réseaux d’actine a attiré énormément d’attention ces dernières années 10,11,12,13,14,15,16,17. Le but de la reconstitution est de construire un modèle minimal de la cellule dépourvu de la régulation biochimique complexe qui existe dans les cellules vivantes. Cela offre un environnement contrôlable pour sonder des activités intracellulaires spécifiques et facilite l’identification et l’analyse des différents composants du cytosquelette d’actine^18,19. De plus, l’encapsulation de réseaux d’actine in vitro à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes phospholipides (GUV, liposomes) fournit un espace confiné mais déformable avec une limite semi-perméable. Il imite le microenvironnement physiologique et mécanique de la machinerie d’actine dans la cellule 9,20,21,22.

Parmi les différentes méthodes de préparation des liposomes, la méthode d’hydratation du film lipidique (également connue sous le nom de méthode de gonflement) est l’une des premières techniques²³. Le film lipidique sec s’hydrate avec l’ajout de tampons, formant des bulles membraneuses qui finissent par devenir des vésicules²⁴. Pour produire des vésicules plus grandes avec un rendement plus élevé, une méthode améliorée passant de la méthode d’hydratation du film, connue sous le nom de méthode d’électroformation²⁵, applique un champ électrique AC pour favoriser efficacement le processus d’hydratation²⁶. Les principales limites de ces méthodes basées sur l’hydratation pour l’encapsulation de l’actine sont qu’elles ont une faible efficacité d’encapsulation des protéines hautement concentrées, et qu’elles ne sont compatibles qu’avec des compositions lipidiques spécifiques²⁴. La technique de l’émulsion inversée, en comparaison, a moins de limitations pour les composants lipidiques et les concentrations de protéines^20,27,28,29. Dans cette méthode, un mélange de protéines pour l’encapsulation est ajouté au tampon aqueux interne, qui est ensuite émulsionné dans une solution d’huile minérale contenant des lipides, formant des gouttelettes lipides-monocouches. Les gouttelettes lipidiques monocouches traversent ensuite une autre interface lipide/huile-eau par centrifugation pour former des vésicules lipidiques bicouches (liposomes). Cette technique s’est avérée être l’une des stratégies les plus efficaces pour l’encapsulation d’actine^24,30. Séparément, il existe certaines méthodes de dispositifs microfluidiques, notamment le jet pulsé^31,32, l’éjection à membrane transitoire 33 et la méthode cDICE ³⁴. Les similitudes entre la méthode d’émulsion inversée et la méthode microfluidique sont le solvant lipidique (huile) utilisé et l’introduction d’une interface lipide/huile-eau pour la formation du feuillet externe des liposomes. En revanche, la génération de liposomes par la méthode microfluidique nécessite une mise en place de dispositifs microfluidiques et s’accompagne d’huile piégée entre les deux feuillets de la bicouche, ce qui nécessite une étape supplémentaire pour l’élimination de l’huile³⁵.

Dans ce manuscrit, nous avons utilisé la technique de l’émulsion inversée pour préparer des liposomes encapsulant un réseau d’actine F polymérisé tel qu’utilisé précédemment²². Le mélange de protéines pour l’encapsulation a d’abord été placé dans un tampon avec des conditions non polymérisantes pour maintenir l’actine sous sa forme globulaire (G). L’ensemble du processus a été effectué à 4 ° C pour empêcher la polymérisation précoce de l’actine, qui a ensuite été déclenchée en permettant à l’échantillon de se réchauffer à température ambiante. Une fois à température ambiante, l’actine polymérise sous sa forme filamenteuse (F). Une variété de protéines liant l’actine peuvent être ajoutées à la solution tampon aqueuse interne pour étudier les fonctionnalités et les propriétés des protéines, fournissant ainsi des informations supplémentaires sur son interaction avec le réseau d’actine et la surface de la membrane. Cette méthode peut également être appliquée à l’encapsulation de diverses protéines d’intérêt³⁶ et de grands objets (microparticules, micronageurs automoteurs, etc.) proches de la taille des liposomes^finaux28,37.

Protocol

1. Préparation des tampons et des solutions protéiques Préparer le tampon aqueux de non-polymérisation interne (INP) dans un volume total de 5 mL en mélangeant 0,1 mM de CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM de DTT, 0,5 mM de Dabco, 320 mM de saccharose et0,2 mM d’ATP. Préparer le mélange de protéines (PM) en ajoutant des protéines au tampon INP à 4 °C avec les concentrations suivantes : 11,2 μM de G-actine non fluorescente, 2,8 μM d’actine marquée par fluore…

Representative Results

La préparation des liposomes basée sur la technique de l’émulsion inversée est illustrée graphiquement et schématiquement sur la figure 1. Tout d’abord, des liposomes vides (nus) (~5-50 μm de diamètre) composés de phospholipides (EPC) et de lipides fluorescents (DHPE) ont été préparés. Un colorant fluorescent rouge vif a été encapsulé dans des liposomes nus comme expérience de contrôle. Il a été possible de déterminer si une monocouche lip…

Discussion

Plusieurs étapes clés déterminent le succès d’un rendement élevé en liposomes pendant le processus de préparation. Pour dissoudre complètement le film lipidique dans l’huile, l’échantillon doit être soniqué jusqu’à ce que le film lipidique au fond du flacon en verre disparaisse complètement. Après la sonication, le mélange lipide-huile doit être stocké pendant la nuit à température ambiante dans des conditions sombres pour que les molécules lipidiques se dispersent davantage^2…

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)	Avanti Polar Lipids Inc.	231615773	Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane	Sigma	D27802-25G	DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton, Inc	AKL99-D	non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton, Inc	AR05	fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma	A2383-10G	ATP
Alexa Fluor 647 dye	ThermoFisher		fluorescent dye
Andor iQ3	Andor Technologies		control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain	Cytoskeleton, Inc	RP01P-A	Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate	Sigma	10035048	CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)	Quorum Technologies		incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant	Cytoskeleton, Inc	CF01-C	cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective)	Andor Technologies	LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA	Sigma	G7528	glucose
Dithiothreitol	DOT Scientific	DSD11000-10	DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant	Cytoskeleton, Inc	HPG6	gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip	Cole-Parmer	UX-07940-53	glass syringe
HEPES	AmericanBio	7365-45-9
ImageJ/Fiji			https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine	Avanti Polar Lipids Inc.	97281442	EPC
Magnesium chloride	Sigma	7786303	MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil	Sigma	8042475	mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His)			VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)	Thermo Fisher	O12650	DHPE
Potassium chloride	Sigma	7447407	KCl
Sucrose	Sigma	57-50-1	sucrose
β-Casein from bovine milk	Sigma	C6905-250MG