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Abstract
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생체공학

इन विट्रो में विशालकाय यूनिलामेलर पुटिकाओं के अंदर एक्टिन साइटोस्केलेटन का पुनर्गठन

Published: August 25, 2022
doi:
10.3791/64026
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Yale University, 2Systems Biology Institute,Yale University, 3Department of Physics,Yale University

Summary

इस पांडुलिपि में, हम एफ-एक्टिन साइटोस्केलेटन को विशाल यूनिलामेलर लिपिड पुटिकाओं (जिसे लिपोसोम भी कहा जाता है) में समाहित करने के लिए प्रयोगात्मक तकनीकों का प्रदर्शन करते हैं, और लिपोसोम झिल्ली के आंतरिक पत्रक पर एक कॉर्टेक्स-बायोमिमिकिंग एफ-एक्टिन परत बनाने की विधि।

Abstract

एक्टिन साइटोस्केलेटन, कोशिका में प्रमुख यांत्रिक मशीनरी, कोशिका विरूपण, विभाजन, प्रवास और आसंजन सहित कई आवश्यक शारीरिक सेलुलर गतिविधियों की मध्यस्थता करती है। हालांकि, विवो में एक्टिन नेटवर्क की गतिशीलता और संरचना का अध्ययन करना जीवित कोशिकाओं के भीतर जैव रासायनिक और आनुवंशिक विनियमन से जटिल है। इंट्रासेल्युलर जैव रासायनिक विनियमन से रहित एक न्यूनतम मॉडल बनाने के लिए, एक्टिन को विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी, जिसे लिपोसोम भी कहा जाता है) के अंदर समझाया जाता है। बायोमिमेटिक लिपोसोम कोशिका के आकार के होते हैं और साइटोस्केलेटन नेटवर्क के यांत्रिक और गतिशील गुणों में मात्रात्मक अंतर्दृष्टि की सुविधा प्रदान करते हैं, जो नीचे-ऊपर सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एक व्यवहार्य मार्ग खोलते हैं। एनकैप्सुलेशन के लिए लिपोसोम उत्पन्न करने के लिए, उल्टे पायस विधि (जिसे इमल्शन ट्रांसफर विधि भी कहा जाता है) का उपयोग किया जाता है, जो विभिन्न सेल-नकल प्रणालियों को तैयार करने के लिए लिपोसोम में जटिल समाधानों को एनकैप्सुलेट करने के लिए सबसे सफल तकनीकों में से एक है। इस विधि के साथ, ब्याज के प्रोटीन का मिश्रण आंतरिक बफर में जोड़ा जाता है, जिसे बाद में मोनोलेयर लिपिड बूंदों को बनाने के लिए फॉस्फोलिपिड युक्त खनिज तेल समाधान में पायसीकृत किया जाता है। वांछित लिपोसोम मोनोलेयर लिपिड बूंदों से उत्पन्न होते हैं जो लिपिड / तेल-पानी इंटरफ़ेस को पार करते हैं। यह विधि वांछित लिपिड घटकों के साथ लिपोसोम में केंद्रित एक्टिन पॉलिमर के एनकैप्सुलेशन को सक्षम बनाती है, जिससे बायोमिमिकिंग साइटोस्केलेटन नेटवर्क के इन विट्रो पुनर्गठन का मार्ग प्रशस्त होता है।

Introduction

एक्टिन साइटोस्केलेटन आणविक स्तर के संकुचन और बल उत्पादन 1,2,3 का समन्वय करके सेल के इंट्रासेल्युलर आर्किटेक्चर के निर्माण में एक मौलिक भूमिका निभाता है। नतीजतन, यह कई आवश्यक सेलुलर गतिविधियों की मध्यस्थता करता है, जिसमें सेल विरूपण 4,5, विभाजन6, माइग्रेशन 7,8 और आसंजन 9 शामिलहैं। एक्टिन नेटवर्क के इन विट्रो पुनर्गठन ने हाल के वर्षों में 10,11,12,13,14,15,16,17 में जबरदस्त ध्यान आकर्षित किया है। पुनर्गठन का लक्ष्य जीवित कोशिकाओं के भीतर मौजूद जटिल जैव रासायनिक विनियमन से रहित सेल का एक न्यूनतम मॉडल बनाना है। यह विशिष्ट इंट्रासेल्युलर गतिविधियों की जांच करने के लिए एक नियंत्रणीय वातावरण प्रदान करता है और एक्टिन साइटोस्केलेटन18,19 के विभिन्न घटकों की पहचान और विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। इसके अलावा, फॉस्फोलिपिड विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी, लिपोसोम) के अंदर इन विट्रो एक्टिन नेटवर्क का एनकैप्सुलेशन अर्ध-पारगम्य सीमा के साथ एक सीमित लेकिन विकृत स्थान प्रदान करता है। यह सेल 9,20,21,22 के भीतर एक्टिन मशीनरी के शारीरिक और यांत्रिक सूक्ष्म वातावरण की नकल करता है।

लिपोसोम तैयार करने के विभिन्न तरीकों में, लिपिड फिल्म हाइड्रेशन विधि (जिसे सूजन विधि के रूप में भी जाना जाता है) सबसे शुरुआती तकनीकों में से एक है23. शुष्क लिपिड फिल्म बफ़र्स के अलावा हाइड्रेट करती है, जिससे झिल्लीदार बुलबुले बनते हैं जो अंततः पुटिका24 बन जाते हैं। उच्च उपज के साथ बड़े पुटिकाओं का उत्पादन करने के लिए, फिल्म हाइड्रेशन विधि से आगे बढ़ने वाली एक बेहतर विधि, जिसे इलेक्ट्रोफॉर्मेशन विधि 25 के रूप में जाना जाता है,जलयोजन प्रक्रिया 26 कोकुशलतापूर्वक बढ़ावा देने के लिए एक एसी विद्युत क्षेत्र लागू करता है। एक्टिन एनकैप्सुलेशन के लिए इन जलयोजन-आधारित तरीकों की प्रमुख सीमाएं यह हैं कि इसमें अत्यधिक केंद्रित प्रोटीन की कम एनकैप्सुलेशन दक्षता है, और यह केवल विशिष्ट लिपिड रचनाओं के साथ संगत है24. उल्टे पायस तकनीक, तुलना में, लिपिड घटकों और प्रोटीन सांद्रता 20,27,28,29 के लिए कम सीमाएं हैं। इस विधि में, एनकैप्सुलेशन के लिए प्रोटीन का मिश्रण आंतरिक जलीय बफर में जोड़ा जाता है, जिसे बाद में लिपिड युक्त खनिज तेल समाधान में पायसीकृत किया जाता है, जिससे लिपिड-मोनोलेयर बूंदें बनती हैं। मोनोलेयर लिपिड बूंदें तब बाइलेयर लिपिड पुटिकाओं (लिपोसोम्स) बनाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से एक और लिपिड / यह तकनीक एक्टिन एनकैप्सुलेशन24,30 के लिए सबसे सफल रणनीतियों में से एक साबित हुई है। अलग-अलग, कुछ माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस विधियां हैं, जिनमें स्पंदित जेटिंग31,32, क्षणिक झिल्ली इजेक्शन33 और सीडीआईएएसई विधि34 शामिल हैं। उल्टे पायस विधि और माइक्रोफ्लुइडिक विधि के बीच समानताएं लिपिड विलायक (तेल) हैं जिनका उपयोग किया जाता है और लिपोसोम के बाहरी पत्रक के गठन के लिए लिपिड / इसके विपरीत, माइक्रोफ्लुइडिक विधि द्वारा लिपोसोम की पीढ़ी को माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के सेट-अप की आवश्यकता होती है और बाइलेयर के दो पत्रकों के बीच फंसे तेल के साथ होता है, जिसके लिए तेल हटाने के लिए एक अतिरिक्त कदम की आवश्यकता होती है35.

इस पांडुलिपि में, हमने एक बहुलकीकृत एफ-एक्टिन नेटवर्क को एनकैप्सुलेट करने वाले लिपोसोम तैयार करने के लिए उल्टे पायस तकनीक का उपयोग किया जैसा कि पहले22 उपयोग किया गया था। एनकैप्सुलेशन के लिए प्रोटीन मिश्रण को पहले एक बफर में रखा गया था जिसमें एक्टिन को अपने गोलाकार (जी) रूप में बनाए रखने के लिए गैर-बहुलक स्थितियां थीं। प्रारंभिक एक्टिन पोलीमराइजेशन को रोकने के लिए पूरी प्रक्रिया 4 डिग्री सेल्सियस पर की गई थी, जिसे बाद में नमूने को कमरे के तापमान पर गर्म करने की अनुमति देकर ट्रिगर किया गया था। एक बार कमरे के तापमान पर, एक्टिन अपने फिलामेंटस (एफ) रूप में पॉलीमराइज़ करता है। प्रोटीन कार्यक्षमताओं और गुणों का अध्ययन करने के लिए आंतरिक जलीय बफर समाधान में विभिन्न प्रकार के एक्टिन-बाध्यकारी प्रोटीन जोड़े जा सकते हैं, इस प्रकार, एक्टिन नेटवर्क और झिल्ली की सतह के साथ इसकी बातचीत में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। इस विधि को ब्याज के विभिन्न प्रोटीनों के एनकैप्सुलेशन पर भी लागू किया जा सकताहै 36 और बड़ी वस्तुओं (माइक्रोपार्टिकल्स, स्व-चालित माइक्रोस्विमर्स, आदि) अंतिम लिपोसोम28,37 के आकार के करीब।

Protocol

1. बफर और प्रोटीन समाधान की तैयारी 0.1 एमएम सीएसीएल 2, 10 एमएम एचईपीईएस (पीएच 7.5), 1 एमएम डीटीटी, 0.5 एमएम डाबको,320 एमएम सुक्रोज और 0.2 एमएम एटीपी को मिलाकर 5 एमएल की कुल मात्रा में जलीय इनर नॉन-पॉलिमराइजे?…

Representative Results

उल्टे पायस तकनीक के आधार पर लिपोसोम की तैयारी चित्रा 1 में ग्राफिक और योजनाबद्ध रूप से सचित्र है। सबसे पहले, खाली (नंगे) लिपोसोम (~ 5-50 μm व्यास) जो फॉस्फोलिपिड (ईपीसी) और फ्लोरोसेंट लिप?…

Discussion

कई महत्वपूर्ण चरण तैयारी प्रक्रिया के दौरान लिपोसोम की उच्च उपज की सफलता का निर्धारण करते हैं। तेल में लिपिड फिल्म को पूरी तरह से भंग करने के लिए, नमूने को तब तक सोनीकेट किया जाना चाहिए जब तक कि कांच की श…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम एमपीएम के लिए एआरओ मुरी डब्ल्यू 911 एनएफ-14-1-0403, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) आर 01 1 आर 01 जीएम 126256 से एमपीएम, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) यू 54 सीए 209992, एनआईएच आरओ 1 जीएम 126256, एनआईएच यू 54 सीए 209992, मिशिगन विश्वविद्यालय / इस सामग्री में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष, निष्कर्ष या सिफारिशें लेखकों (ओं) की हैं और जरूरी नहीं कि एआरओ, एनआईएच या एचएफएसपी के विचारों को प्रतिबिंबित करें। एससी वी यादव, सी मुरेसन और एस अमीरी के साथ सार्थक चर्चा को स्वीकार करता है।

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)  Avanti Polar Lipids Inc. 231615773 Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802-25G DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AKL99-D non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AR05 fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma A2383-10G ATP
Alexa Fluor 647 dye ThermoFisher fluorescent dye
Andor iQ3 Andor Technologies control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain Cytoskeleton, Inc RP01P-A Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate Sigma 10035048 CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) Quorum Technologies incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant Cytoskeleton, Inc CF01-C cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) Andor Technologies LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA Sigma G7528 glucose
Dithiothreitol DOT Scientific  DSD11000-10 DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant Cytoskeleton, Inc HPG6 gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip Cole-Parmer UX-07940-53 glass syringe
HEPES AmericanBio 7365-45-9
ImageJ/Fiji https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids Inc. 97281442 EPC
Magnesium chloride Sigma 7786303 MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil Sigma 8042475 mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) Thermo Fisher O12650 DHPE
Potassium chloride Sigma 7447407 KCl
Sucrose Sigma 57-50-1 sucrose
β-Casein from bovine milk Sigma C6905-250MG
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Keywords: Actin CytoskeletonIn Vitro ReconstitutionGiant Unilamellar VesiclesLiposome YieldEncapsulation EfficiencyProtein EncapsulationMicroparticle EncapsulationSelf-propelling MicroswimmersNon-polymerization BufferPolymerization BufferEGGPCNickel Lipid
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Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (186), e64026, doi:10.3791/64026 (2022).
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