In vitro Ricostituzione del citoscheletro di actina all'interno di vescicole unilamellari giganti

Summary

In questo manoscritto, dimostriamo le tecniche sperimentali per incapsulare il citoscheletro F-actina in vescicole lipidiche unilamellari giganti (chiamate anche liposomi) e il metodo per formare uno strato di F-actina che imita la corteccia nel foglietto interno della membrana liposomiale.

Abstract

Il citoscheletro di actina, il principale macchinario meccanico nella cellula, media numerose attività fisiche cellulari essenziali, tra cui la deformazione, la divisione, la migrazione e l’adesione cellulare. Tuttavia, lo studio della dinamica e della struttura della rete di actina in vivo è complicato dalla regolazione biochimica e genetica all’interno delle cellule vive. Per costruire un modello minimale privo di regolazione biochimica intracellulare, l’actina viene incapsulata all’interno di vescicole unilamellari giganti (GUV, chiamate anche liposomi). I liposomi biomimetici sono di dimensioni cellulari e facilitano una comprensione quantitativa delle proprietà meccaniche e dinamiche della rete del citoscheletro, aprendo una strada praticabile per la biologia sintetica bottom-up. Per generare liposomi per l’incapsulamento, viene utilizzato il metodo dell’emulsione invertita (noto anche come metodo di trasferimento dell’emulsione), che è una delle tecniche di maggior successo per incapsulare soluzioni complesse in liposomi per preparare vari sistemi di imitazione cellulare. Con questo metodo, una miscela di proteine di interesse viene aggiunta al tampone interno, che viene successivamente emulsionato in una soluzione di olio minerale contenente fosfolipidi per formare goccioline lipidiche monostrato. I liposomi desiderati sono generati da goccioline lipidiche monostrato che attraversano un’interfaccia lipide/olio-acqua. Questo metodo consente l’incapsulamento di polimeri di actina concentrati nei liposomi con i componenti lipidici desiderati, aprendo la strada alla ricostituzione in vitro di una rete di citoscheletri biomima.

Introduction

Il citoscheletro di actina svolge un ruolo fondamentale nella costruzione dell’architettura intracellulare della cellula coordinando la contrattilità a livello molecolare e la generazione di forza ^1,2,3. Di conseguenza, media numerose attività cellulari essenziali, tra cui la deformazione cellulare^4,5, la divisione⁶, la migrazione ^7,8 e l’adesione⁹. La ricostituzione in vitro delle reti di actina ha guadagnato enorme attenzione negli ultimi anni 10,11,12,13,14,15,16,17. L’obiettivo della ricostituzione è quello di costruire un modello minimo della cellula privo della complessa regolazione biochimica che esiste all’interno delle cellule vive. Ciò offre un ambiente controllabile per sondare specifiche attività intracellulari e facilita l’identificazione e l’analisi di diversi componenti del citoscheletro di actina^18,19. Inoltre, l’incapsulamento di reti di actina in vitro all’interno di vescicole unilamellari giganti fosfolipidi (GUV, liposomi) fornisce uno spazio confinato ma deformabile con un confine semipermeabile. Imita il microambiente fisiologico e meccanico del macchinario dell’actina all’interno della cellula 9,20,21,22.

Tra i vari metodi per preparare i liposomi, il metodo di idratazione del film lipidico (noto anche come metodo del gonfiore) è una delle prime tecniche²³. Il film lipidico secco idrata con l’aggiunta di tamponi, formando bolle membranose che alla fine diventano vescicole²⁴. Per produrre vescicole più grandi con una resa più elevata, un metodo migliorato che avanza dal metodo di idratazione del film, noto come metodo di elettroformazione²⁵, applica un campo elettrico CA per promuovere in modo efficiente il processo di idratazione²⁶. I principali limiti di questi metodi basati sull’idratazione per l’incapsulamento di actina sono che ha una bassa efficienza di incapsulamento di proteine altamente concentrate ed è compatibile solo con specifiche composizioni lipidiche²⁴. La tecnica dell’emulsione invertita, in confronto, ha meno limitazioni per i componenti lipidici e le concentrazioni proteiche^20,27,28,29. In questo metodo, una miscela di proteine per l’incapsulamento viene aggiunta al tampone acquoso interno, che viene successivamente emulsionato in una soluzione di olio minerale contenente lipidi, formando goccioline monostrato lipidiche. Le goccioline lipidiche monostrato attraversano quindi un’altra interfaccia lipide/olio-acqua attraverso la centrifugazione per formare vescicole lipidiche a doppio strato (liposomi). Questa tecnica ha dimostrato di essere una delle strategie di maggior successo per l’incapsulamento di actina^24,30. Separatamente, ci sono alcuni metodi di dispositivi microfluidici, tra cui il getto pulsato 31,32^, l’espulsione transitoria della membrana³³ e il metodo cDICE³⁴. Le somiglianze tra il metodo dell’emulsione invertita e il metodo microfluidico sono il solvente lipidico (olio) utilizzato e l’introduzione dell’interfaccia lipide/olio-acqua per la formazione del foglietto esterno dei liposomi. Al contrario, la generazione di liposomi con il metodo microfluidico richiede una messa a punto di dispositivi microfluidici ed è accompagnata da olio intrappolato tra i due lembi del doppio strato, che richiede un passaggio supplementare per la rimozione dell’olio³⁵.

In questo manoscritto, abbiamo usato la tecnica dell’emulsione invertita per preparare liposomi che incapsulano una rete polimerizzata F-actina come usato in precedenza²². La miscela proteica per l’incapsulamento è stata prima posta in un tampone con condizioni non polimerizzanti per mantenere l’actina nella sua forma globulare (G). L’intero processo è stato eseguito a 4 °C per prevenire la polimerizzazione precoce dell’actina, che è stata successivamente innescata consentendo al campione di riscaldarsi a temperatura ambiente. Una volta a temperatura ambiente, l’actina polimerizza nella sua forma filamentosa (F). Una varietà di proteine leganti l’actina può essere aggiunta alla soluzione tampone acquosa interna per studiare le funzionalità e le proprietà delle proteine, fornendo così ulteriori informazioni sulla sua interazione con la rete di actina e la superficie della membrana. Questo metodo può essere applicato anche all’incapsulamento di varie proteine di interesse³⁶ e oggetti di grandi dimensioni (microparticelle, micronuotatori semoventi, ecc.) vicini alla dimensione dei liposomi finali ^28,37.

Protocol

1. Preparazione di tamponi e soluzioni proteiche Preparare il tampone acquoso interno di non polimerizzazione (INP) in un volume totale di 5 mL miscelando 0,1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM saccarosio e0,2 mM ATP. Preparare il mix proteico (PM) aggiungendo proteine al tampone INP a 4 °C con le seguenti concentrazioni: 11,2 μM di G-actina non fluorescente, 2,8 μM di actina marcata con fluorescenza e 0,24 μM di Arp2/3 (Tabella dei …

Representative Results

La preparazione dei liposomi basata sulla tecnica dell’emulsione invertita è illustrata graficamente e schematicamente nella Figura 1. In primo luogo, sono stati preparati liposomi vuoti (~ 5-50 μm di diametro) composti da fosfolipidi (EPC) e lipidi fluorescenti (DHPE). Un colorante fluorescente brillante e rosso lontano è stato incapsulato all’interno di liposomi nudi come esperimento di controllo. Se un monostrato lipidico si è formato con successo nella per…

Discussion

Diversi passaggi chiave determinano il successo di un’alta resa di liposomi durante il processo di preparazione. Per sciogliere completamente il film lipidico nell’olio, il campione deve essere sonicato fino a quando il film lipidico sul fondo della fiala di vetro scompare completamente. Dopo la sonicazione, la miscela di olio lipidico deve essere conservata durante la notte a temperatura ambiente in condizioni di oscurità affinché le molecole lipidiche si disperdano ulteriormente²⁹. La miscela …

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)	Avanti Polar Lipids Inc.	231615773	Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane	Sigma	D27802-25G	DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton, Inc	AKL99-D	non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle	Cytoskeleton, Inc	AR05	fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma	A2383-10G	ATP
Alexa Fluor 647 dye	ThermoFisher		fluorescent dye
Andor iQ3	Andor Technologies		control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain	Cytoskeleton, Inc	RP01P-A	Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate	Sigma	10035048	CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip)	Quorum Technologies		incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant	Cytoskeleton, Inc	CF01-C	cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective)	Andor Technologies	LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA	Sigma	G7528	glucose
Dithiothreitol	DOT Scientific	DSD11000-10	DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant	Cytoskeleton, Inc	HPG6	gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip	Cole-Parmer	UX-07940-53	glass syringe
HEPES	AmericanBio	7365-45-9
ImageJ/Fiji			https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine	Avanti Polar Lipids Inc.	97281442	EPC
Magnesium chloride	Sigma	7786303	MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil	Sigma	8042475	mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His)			VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)	Thermo Fisher	O12650	DHPE
Potassium chloride	Sigma	7447407	KCl
Sucrose	Sigma	57-50-1	sucrose
β-Casein from bovine milk	Sigma	C6905-250MG