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생체공학

インビトロ 巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成

Published: August 25, 2022
doi:
10.3791/64026
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Yale University, 2Systems Biology Institute,Yale University, 3Department of Physics,Yale University

Summary

本稿では、F-アクチン細胞骨格を巨大な単層脂質小胞(リポソームとも呼ばれる)に封入する実験技術と、リポソーム膜の内小葉に皮質生物模倣型F-アクチン層を形成する方法を示す。

Abstract

細胞内の主要な機械的機構であるアクチン細胞骨格は、細胞の変形、分裂、遊走、および接着を含む多数の重要な物理的細胞活動を媒介する。しかし、 インビボ でのアクチンネットワークのダイナミクスと構造の研究は、生細胞内の生化学的および遺伝的調節によって複雑になる。細胞内生化学的調節を欠いた最小モデルを構築するために、アクチンは巨大な単層小胞(GUV、リポソームとも呼ばれる)の内部に封入される。生体模倣リポソームは細胞サイズであり、細胞骨格ネットワークの機械的および動的特性に対する定量的洞察を容易にし、ボトムアップ合成生物学のための実行可能なルートを開く。封入用のリポソームを生成するために、反転エマルジョン法(エマルジョン移動法とも呼ばれる)が利用され、これは複雑な溶液をリポソームに封入して様々な細胞模倣系を調製するための最も成功した技術の1つである。この方法では、目的のタンパク質の混合物を内部緩衝液に添加し、これを後でリン脂質含有鉱物油溶液に乳化させて単層脂肪滴を形成する。所望のリポソームは、脂質/油水界面を横切る単層脂肪滴から生成される。この方法は、所望の脂質成分を含むリポソームへの濃縮アクチンポリマーのカプセル化を可能にし、生体模倣細胞骨格ネットワークの in vitro 再構成への道を開く。

Introduction

アクチン細胞骨格は、分子レベルの収縮性と力発生1,2,3を調整することによって、細胞の細胞内構造を構築する上で基本的な役割を果たす。その結果、細胞変形4、5、分裂6、遊走7、8、および接着9を含む多数の重要な細胞活動を媒介する。アクチンネットワークのインビトロ再構成は、近年10、11、12、13、14、15、16、17で大きな注目を集めている。再構成の目標は、生細胞内に存在する複雑な生化学的調節を欠いている細胞の最小モデルを構築することである。これは、特定の細胞内活動をプローブするための制御可能な環境を提供し、アクチン細胞骨格18、19の異なる成分の同定および分析を容易にする。さらに、リン脂質巨大単層小胞(GUV、リポソーム)内のインビトロアクチンネットワークのカプセル化は、半透過性の境界を有する閉じ込められたが変形可能な空間を提供する。細胞9、20、21、22内のアクチン機構の生理学的および機械的微小環境を模倣する。

リポソームを調製するための様々な方法の中で、脂質膜水和法(膨潤法としても知られる)は、最も初期の技術の1つである23。乾燥脂質膜は、緩衝液を添加して水和し、膜状の気泡を形成し、最終的に小胞24となる。より大きな小胞をより高い収率で製造するために、電形成法25として知られる膜水和法から進歩する改良された方法は、交流電界を印加して水和プロセス26を効率的に促進する。アクチン封入のためのこれらの水和ベースの方法の主な制限は、高濃度タンパク質のカプセル化効率が低く、かつ特定の脂質組成物とのみ適合性があることである24。この反転エマルジョン技術は、比較して、脂質成分およびタンパク質濃度に対する制限が少ない20、27、28、29である。この方法では、カプセル化のためのタンパク質の混合物が内部水性緩衝液に添加され、これは後で脂質含有鉱物油溶液中で乳化され、脂質単層液滴を形成する。次いで、単層脂肪滴は、遠心分離を介して別の脂質/油水界面を通過し、二重層脂質小胞(リポソーム)を形成する。この技術は、アクチンカプセル化のための最も成功した戦略の1つであることが証明されています24,30。これとは別に、パルス噴出31、32、過渡膜噴出33、およびcDICE法34を含むいくつかのマイクロ流体デバイス法がある。逆乳化法とマイクロ流体法の類似点は、利用される脂質溶媒(油)と、リポソームの外側小葉の形成のための脂質/油水界面の導入である。対照的に、マイクロ流体法によるリポソームの生成は、マイクロ流体デバイスのセットアップを必要とし、二重層の2つの小葉の間に閉じ込められた油を伴い、これは、油除去のための余分なステップを必要とする35。

この原稿では、以前に使用したように、逆エマルジョン技術を使用して、重合F-アクチンネットワークを封入したリポソームを調製した22。封入用のタンパク質混合物を、まず、アクチンをその球状(G)形態に維持するために、非重合条件を有する緩衝液に入れた。初期のアクチン重合を防ぐために、全プロセスを4°Cで実施し、後にサンプルを室温まで昇温させることによって引き起こされた。室温で一旦、アクチンは重合して糸状(F)形態になる。様々なアクチン結合タンパク質を内部水性緩衝液に添加して、タンパク質の機能性および特性を研究することができ、したがって、アクチンネットワークおよび膜表面との相互作用に関する洞察をさらに提供する。この方法は、最終リポソーム28、37のサイズに近い目的の様々なタンパク質36および大きな物体(微粒子、自走式マイクロスイマーなど)の封入にも適用することができる。

Protocol

1. 緩衝液およびタンパク質溶液の調製 0.1 mM CaCl 2、10 mM HEPES (pH 7.5)、1 mM DTT、0.5 mM Dabco、320 mM スクロース、および 0.2 mM ATP を混合して、全容量 5 mL の水性内部非重合 (INP) バッファーを調製します。 タンパク質ミックス(PM)を調製するには、11.2 μM 非蛍光 G-アクチン、2.8 μM 蛍光標識アクチン、および 0.24 μM Arp2/3 (材料表) の濃度で INP バッファー?…

Representative Results

反転エマルジョン技術に基づくリポソームの調製を、 図1にグラフィカルかつ概略的に例示する。 まず、リン脂質(EPC)および蛍光脂質(DHPE)で構成された空(ベア)リポソーム(直径約5〜50μm)を調製した。対照実験として、明るい遠赤色蛍光色素を裸のリポソーム内に封入した。液滴の周囲に脂質単層が首尾よく形成されたかどうかは、図…

Discussion

いくつかの重要なステップは、調製プロセス中の高収率のリポソームの成功を決定する。油中の脂質膜を完全に溶解するには、ガラスバイアルの底部の脂質膜が完全に消失するまでサンプルを超音波処理しなければならない。超音波処理の後、脂質 – 油混合物は、脂質分子がさらに分散するために暗条件下で室温で一晩保存されなければならない29。混合物は、4°Cで最大1週…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は、ARO MURI W911NF-14-1-0403 to M.P.M.、米国国立衛生研究所(NIH)R01 1R01GM126256からM.P.M.、米国国立衛生研究所(NIH)U54 CA209992、NIH RO1 GM126256、NIH U54 CA209992、ミシガン大学/ジェネンテック、SUBK00016255及びヒューマン・フロンティア・サイエンス・プログラム(HFSP)の助成金番号RGY0073/2018からM.P.M.への資金提供を認める。この資料に記載されている意見、所見、結論、または推奨事項は著者のものであり、必ずしもARO、NIH、またはHFSPの見解を反映するものではありません。S.C.は、V.ヤダヴ、C.ムレサン、S.アミリとの実りある議論を認める。

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)  Avanti Polar Lipids Inc. 231615773 Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802-25G DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AKL99-D non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AR05 fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma A2383-10G ATP
Alexa Fluor 647 dye ThermoFisher fluorescent dye
Andor iQ3 Andor Technologies control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain Cytoskeleton, Inc RP01P-A Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate Sigma 10035048 CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) Quorum Technologies incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant Cytoskeleton, Inc CF01-C cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) Andor Technologies LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA Sigma G7528 glucose
Dithiothreitol DOT Scientific  DSD11000-10 DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant Cytoskeleton, Inc HPG6 gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip Cole-Parmer UX-07940-53 glass syringe
HEPES AmericanBio 7365-45-9
ImageJ/Fiji https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids Inc. 97281442 EPC
Magnesium chloride Sigma 7786303 MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil Sigma 8042475 mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) Thermo Fisher O12650 DHPE
Potassium chloride Sigma 7447407 KCl
Sucrose Sigma 57-50-1 sucrose
β-Casein from bovine milk Sigma C6905-250MG
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Keywords: Actin CytoskeletonIn Vitro ReconstitutionGiant Unilamellar VesiclesLiposome YieldEncapsulation EfficiencyProtein EncapsulationMicroparticle EncapsulationSelf-propelling MicroswimmersNon-polymerization BufferPolymerization BufferEGGPCNickel Lipid
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Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (186), e64026, doi:10.3791/64026 (2022).
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