Summary
Le présent protocole décrit comment greffer de la peau humaine sur des souris non obèses diabétiques (NOD)-SCID à récepteur de la chaîne gamma (NSG) diabétiques (NOD). Une description détaillée de la préparation de la peau humaine pour la transplantation, de la préparation des souris pour la transplantation, de la transplantation de la peau humaine d’épaisseur fendue et de la procédure de récupération post-transplantation est incluse dans le rapport.
Abstract
Le modèle de xénogreffe de peau humaine, dans lequel la peau d’un donneur humain est transplantée sur un hôte souris immunodéficient, est une option importante pour la recherche translationnelle en immunologie de la peau. La peau murine et la peau humaine diffèrent considérablement dans l’anatomie et la composition des cellules immunitaires. Par conséquent, les modèles murins traditionnels ont des limites pour la recherche dermatologique et la découverte de médicaments. Cependant, les xénotransplantations réussies sont techniquement difficiles et nécessitent une préparation optimale du site de greffe et du greffon de souris pour la survie du greffon et de l’hôte. Le présent protocole fournit une technique optimisée pour la transplantation de peau humaine sur des souris et discute des considérations nécessaires pour les objectifs expérimentaux en aval. Ce rapport décrit la préparation appropriée d’un échantillon de peau de donneur humain, l’assemblage d’une installation chirurgicale, la préparation de souris et de sites chirurgicaux, la transplantation de peau et la surveillance post-chirurgicale. L’adhésion à ces méthodes permet le maintien des xénogreffes pendant plus de 6 semaines après la chirurgie. Les techniques décrites ci-dessous permettent une efficacité maximale de greffage grâce au développement de contrôles techniques, de techniques stériles et de conditionnement pré et post-chirurgical. La performance appropriée du modèle de xénogreffe permet d’obtenir des échantillons de greffe de peau humaine à longue durée de vie pour la caractérisation expérimentale de la peau humaine et les essais précliniques de composés in vivo.
Introduction
Les modèles murins sont fréquemment utilisés pour faire des inférences sur la biologie humaine et la maladie, en partie en raison de leur reproductibilité expérimentale et de leur capacité de manipulation génétique. Cependant, la physiologie de la souris ne récapitule pas complètement les systèmes d’organes humains, en particulier la peau, et présente donc des limites pour être utilisée comme modèle préclinique dans le développement de médicaments1. Les différences anatomiques entre la peau de souris et la peau humaine comprennent des différences d’épaisseurs épithéliales et d’architecture, l’absence de glandes sudoripares eccrines murines et des variations dans le cycle des cheveux2. De plus, les bras innés et adaptatifs du système immunitaire divergent entre les deux espèces3. La peau de souris contient une population immunitaire unique de lymphocytes T épidermiques dendritiques (DETC), a une plus grande abondance de cellules T γδ dermiques et varie dans la localisation du sous-ensemble de cellules immunitaires par rapport au tissu humain4. Par conséquent, les résultats expérimentaux concernant la biologie de la peau humaine et l’inflammation bénéficient d’une validation avec des tissus humains. Alors que les systèmes de culture in vitro et organoïdes sont des outils largement utilisés pour étudier les tissus humains, ces systèmes sont limités par une reconstitution immunitaire absente ou incomplète et un manque de connexion au système vasculaire périphérique5. Le modèle de greffe de peau de xénogreffe humanisée vise à permettre la manipulation thérapeutique ou biologique des voies immunitaires et non immunitaires dans les tissus humains in vivo.
Le modèle de xénogreffe de peau humaine a été utilisé pour étudier la physiologie et la pharmacologie de la peau, analyser le rejet immunitaire et les réponses, disséquer les mécanismes du cancer de la peau humaine et comprendre les maladies de la peau et la cicatrisation des plaies6. Bien qu’applicable à de multiples domaines de recherche sur la peau, le modèle de xénogreffe a un débit inférieur à celui des études in vitro et n’a pas la facilité de manipulation génétique utilisée dans les modèles murins. Les périodes de ce modèle peuvent varier de quelques semaines à quelques mois, et une greffe réussie nécessite des installations et un équipement appropriés pour effectuer ces chirurgies. Cependant, le modèle de xénogreffe fournit un contexte biologique et physiologique aux expériences, tandis que les systèmes de culture organoïdes, tels que les explants tissulaires, nécessitent souvent la réplication d’une myriade de pièces mobiles, telles que des signaux exogènes, à des intervalles de temps spécifiques7. Par conséquent, il est préférable d’utiliser ce modèle pour valider davantage les résultats observés in vitro et dans des modèles murins, ou pour des travaux qui ne sont pas autrement réalisables sur le plan biologique. L’utilisation appropriée du modèle de xénogreffe offre une occasion unique d’étudier et de manipuler des tissus humains intacts in vivo.
L’optimisation du modèle de greffe de peau de xénogreffe s’est appuyée sur des décennies de recherche pour préserver l’intégrité du greffon au fil du temps. L’utilisation de la souris non obèse diabétique (NOD)-scid à récepteur de la chaîne gamma (NSG) de l’interleukine-2, qui manque de cellules immunitaires adaptatives B et T, de cellules NK fonctionnelles et présente des déficiences en macrophages et en cellules dendritiques8. La nature immunodéficiente de ces hôtes NSG permet la transplantation de cellules hématopoïétiques humaines, de cancers dérivés de patients et de peau 8,9,10. Malgré cet environnement hôte immunosuppresseur, une suppression supplémentaire des réponses immunitaires neutrophiles de la souris par administration d’anti-GR1 est nécessaire pour le succès du greffon10. Les principaux obstacles à la transplantation de tissus intacts sont l’infection, le rejet et la difficulté à rétablir le flux sanguin vers le greffon, entraînant parfois une perte d’intégrité cutanée et épidermique11. Les techniques telles que l’administration d’anti-FR1 et l’utilisation d’une profondeur de greffe appropriée améliorent la survie du greffon10. Une optimisation méticuleuse permet d’effectuer des greffes de peau de xénogreffe humaine sur des souris NSG avec des taux d’efficacité et de survie élevés, allant de 90% à 100%.
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Protocol
La présente étude a été approuvée et réalisée conformément aux protocoles UCSF IACUC (AN191105-01H) et IRB (13-11307). Des échantillons de peau, jetés dans le cadre d’interventions chirurgicales électives de routine, telles que la réparation d’une hernie, ont été utilisés pour la présente recherche. Les échantillons de peau sont soit anonymisés et certifiés comme étant des sujets non humains, soit, si des renseignements d’identification clinique sont requis pour les analyses en aval, les patients ont donné leur consentement écrit en vertu du protocole 13-11307 de la CISR. Aucun autre critère d’inclusion ou d’exclusion n’a été utilisé. Des souris NSG des deux sexes, âgées de 8 à 10 semaines, ont été employées dans l’étude. Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux).
1. Traitement de l’échantillon de peau humaine du donneur
REMARQUE : L’échantillon de peau humaine utilisé dans cette greffe était un grand échantillon prélevé dans l’abdomen d’un patient en bonne santé. L’échantillon doit mesurer au moins 15 cm x 7,5 cm. Les limites de taille peuvent affecter le nombre de souris pour lesquelles la peau est disponible et le choix de la taille du greffon.
- Conserver l’échantillon de peau à des températures froides (sur glace; 4 °C) avant la préparation et la greffe. Gardez l’échantillon humide dans une tasse de prélèvement fermée avec la gaze imbibée de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
REMARQUE: Il n’est pas recommandé de conserver l’échantillon de peau à 4 °C pendant plus de 2 jours. Cependant, il existe des rapports où les échantillons de peau sont stockés plus longtemps12.
ATTENTION : Traiter tous les tissus humains avec des précautions standard contre les risques biologiques. - Préparez-vous à dermatomater l’échantillon de peau humaine dans une hotte de culture tissulaire stérilisée à pression négative sur une planche de dissection stérilisée.
- Placez l’échantillon de peau, côté épiderme vers le haut, sur la planche de dissection. Essuyez l’épiderme avec un tampon de préparation à l’alcool stérile, puis avec PBS.
- Épinglez le bord le plus proche de la peau en place avec une broche en T de 1,5 en dissection (voir le tableau des matériaux).
- Dermatome l’échantillon de peau à une épaisseur de 400 μm, en appliquant une pression constante tout en coupant vers l’avant à un angle de 30°-45°. Suivez toutes les instructions et mesures de sécurité propres à l’instrument (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE: Pour plus de détails sur la technique dermatome, veuillez consulter un rapport publié précédemment13. - Préparez une boîte de Petri de 100 mm x 20 mm en plaçant une gaze stérile imbibée de PBS stérile au fond de la boîte. Placez la peau, côté épiderme vers le haut, sur la gaze humide.
- Scellez et recouvrez les bords de la plaque avec un film d’étanchéité semi-transparent (voir le tableau des matériaux) pour vous assurer que l’échantillon n’est pas contaminé. Conservez l’échantillon à 4 °C avant la greffe.
2. Conditionnement et préparation préopératoires
- Préparez les instruments stériles et une station chirurgicale stérile pour la greffe. Utilisez des serviettes en papier autoclavées comme surfaces stériles pour le placement des instruments et de la souris.
REMARQUE: Les souris peuvent être greffées après le sevrage, mais sont de préférence greffées entre 8 et 10 semaines. Des souris des deux sexes peuvent être greffées. - Effectuer la préparation chirurgicale, telle que l’épilation, dans une zone physiquement séparée du poste chirurgical.
- Préparer l’anti-GR1 (voir le tableau des matières) en le diluant à 1 mg/mL dans une solution saline stérile. Administrer 100 μg/100 μL à chaque souris de la solution anti-GR1 par voie intrapéritonéale après induction de l’anesthésie.
- Anesthésiez les souris, une à la fois, avec de l’isoflurane ou d’autres anesthésiques approuvés par l’institution.
NOTE: L’isoflurane doit être administré à une concentration de 3% à 5% pendant l’induction. Une fois que la souris est immobile, abaissez la concentration d’isoflurane à 1%-3% pour effectuer pendant toute la durée de la chirurgie.- Surveillez la profondeur appropriée de l’anesthésie de la souris en observant la fréquence respiratoire, l’absence de réponse de pincement des orteils et la coloration rose appropriée des oreilles et de la bouche.
ATTENTION : Utilisez des machines anesthésiques et des méthodes de récupération appropriées, et évitez l’exposition aux vapeurs d’isoflurane.
- Surveillez la profondeur appropriée de l’anesthésie de la souris en observant la fréquence respiratoire, l’absence de réponse de pincement des orteils et la coloration rose appropriée des oreilles et de la bouche.
- Transférez la souris sur un coussin chauffant ou une autre source de chaleur (voir le tableau des matériaux).
- Administrer la pommade ophtalmique en tamponnant une petite goutte de pommade sur l’œil avec un doigt ganté.
- Administrer les analgésiques Buprénorphine (0,08 mg/kg) et Carprofène (5 mg/kg) (voir le tableau des matières) par voie sous-cutanée en pinçant la peau et en injectant à un angle parallèle au corps.
REMARQUE : Préparer l’analgésie prétraitement en suivant les protocoles institutionnels. Suivre les directives institutionnelles pour la sélection et l’administration des analgésiques. La méthode d’analgésie utilisée dans cette étude est décrite à l’étape 2.7 et à la figure supplémentaire 1. - Administrer l’anti-GR1 (préparé à l’étape 2.4) par voie intrapéritonéale en soulevant légèrement la souris par la queue, en exposant l’abdomen et en l’injectant à un angle de 30° à l’aide d’une seringue à insuline de 1 mL (12,7 mm).
- Utilisez des tondeuses électriques sans danger pour les animaux (voir le tableau des matériaux) pour raser les parties médiane et supérieure de la face dorsale de la souris.
- Effacez tous les poils et appliquez une quantité généreuse de pommade dépilatoire sur la peau rasée pendant 30 s à 1 min.
- Essuyez complètement la pommade épilatoire avec une serviette en papier et du PBS.
3. Procédure de transplantation
- Transférez la souris dans un emplacement chirurgical secondaire, loin du poste d’épilation.
- Stérilisez le site chirurgical avec le bâtonnet d’écouvillon d’iode dans un mouvement circulaire, en commençant par le milieu et en travaillant vers le bord de la zone épilée.
- Placez un morceau de pellicule de plastique stérile sur la souris et coupez une fenêtre dans le plastique légèrement plus grande que la taille de la zone à greffer.
- Couper une partie rectangulaire de 10 mm x 10 mm de peau de donneur à greffer avec un scalpel. Pour ce faire, maintenez fermement la peau du donneur en place avec l’arrière de la pince et coupez le long de la pince avec le scalpel.
- À l’aide des ciseaux chirurgicaux, coupez une zone rectangulaire de peau de souris correspondant à la taille de la pièce de peau du donneur, créant ainsi un lit de greffe. Utilisez des pinces pour éloigner la peau du corps et coupez la peau avec les ciseaux inclinés loin du corps pour éviter de couper profondément dans le visage.
- Placez le morceau de peau du donneur, côté épiderme vers le haut, sur le lit de greffe préparé.
- À l’aide de l’arrière des forceps, manipulez la peau en glissant d’avant en arrière jusqu’à ce que la peau du donneur repose complètement à plat contre le lit de greffe.
- Ajouter des gouttes d’adhésif pour tissu de colle chirurgicale (voir le tableau des matériaux) à l’endroit où la peau du donneur rencontre la peau de la souris et maintenir la peau de la souris et du donneur ensemble avec une pince pendant 1-2 s afin que la colle adhère aux tissus. Scellez complètement le bord de la greffe et laissez la colle sécher complètement.
- Bandez les souris (Figure 1) en suivant les étapes ci-dessous.
- Coupez un morceau de gaze de vaseline (voir le tableau des matériaux) assez grand pour couvrir complètement la zone de greffe.
- Couvrir la greffe avec la gaze de vaseline et appuyer légèrement la gaze contre la peau à l’aide d’une pince.
- Coupez une bande d’un pansement transparent dans le sens de la longueur afin que la largeur soit assez grande pour couvrir la blessure de la souris.
- Appuyez fermement sur le pansement de film transparent, côté adhésif vers le bas, sur la gaze. Faites rouler rapidement la souris pour enrouler complètement le pansement autour du torse, en vous assurant qu’il s’adapte bien sans entraver la respiration et que tous les membres sont libres de mouvement.
- Placez la souris dans une cage de récupération et surveillez-la jusqu’à ce qu’elle soit alerte et se déplace. Fournir une source de chaleur sur une partie de la cage pendant au moins 15 minutes après la récupération.
REMARQUE : On s’attend à ce que les animaux se rétablissent dans un délai de 1 à 5 minutes après les avoir placés dans la cage de récupération.
- Abriter individuellement les souris après greffe.
- Administrer l’analgésie post-chirurgicale tel que requis par les protocoles de l’établissement.
REMARQUE : La buprénorphine (0,08 mg/kg) a été administrée par voie sous-cutanée 4 à 6 heures plus tard au cours de la présente étude.
4. Interventions post-chirurgicales
- Injecter 100 μL (100 μg) d’anti-GR1 par voie intrapéritonéale 4 jours, 7 jours et 11 jours après la greffe pour prévenir le rejet du greffon (Figure supplémentaire 1).
- Remplacez les bandages au besoin et s’ils sont enlevés par des souris.
- Rebander toutes les souris le jour 7.
- Retirez les bandages le jour 14.
- Surveillez les souris pour détecter les signes de rejet de greffe et d’inflammation systémique (perte de poids, perte de cheveux, léthargie extrême).
- Récolter les souris entre 3 et 6 semaines après la greffe.
- Euthanasier les souris par administration de dioxyde de carbone (CO2) contrôlée par régulateur suivie d’une luxation cervicale.
REMARQUE : Suivez les lignes directrices de l’établissement pour l’euthanasie. - Disséquer les greffes de peau des souris14. Placer une partie du greffon dans du formol à 10% pendant 24 h avant l’enrobage de la paraffine et la section pour la coloration histologique9.
- Hacher les greffes de peau avec des ciseaux et les digérer par voie enzymatique avec 250 UI/mL de collagénase IV et 0,02 mg/mL de DNase dans des milieux de culture cellulaire pendant la nuit. Colorer les cellules pour les marqueurs de surface et intracellulaires en suivant la procédure décrite précédemment14.
- Euthanasier les souris par administration de dioxyde de carbone (CO2) contrôlée par régulateur suivie d’une luxation cervicale.
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Representative Results
Des xénogreffes de peau humaine ont été effectuées sur des souris NSG à l’intérieur d’une animalerie super-barrière. Le succès a été défini par la survie prolongée du greffon et de la souris et la santé comportementale des souris après la greffe. Une faible survie au cours de la semaine suivant la chirurgie a d’abord été observée comme le plus grand obstacle au succès expérimental, avec jusqu’à 50% des souris nécessitant une euthanasie. L’amélioration de la technique stérile et un meilleur soutien de la température corporelle de la souris pendant et immédiatement après la chirurgie ont augmenté la survie chirurgicale de manière constante à plus de 80% et souvent à 90%-100% de survie. Bien que l’ajout d’antibiotiques dans l’eau potable de la souris ait été testé, il n’a pas été déterminé qu’il améliorait les résultats et a été abandonné en tant que facteur de confusion potentiel des résultats. Les souris greffées avec succès devraient apparaître actives et en bonne santé dans les jours suivant la greffe. Les souris se déplaçaient autour de leur cage, exploraient, construisaient des nids, mangeaient et buvaient comme d’habitude. Une souris malade peut sembler paresseuse, non réactive et peut ne pas manger ou boire suffisamment pour maintenir son poids. La supplémentation de souris léthargiques avec des options d’alimentation molle et d’hydratation orale peut aider à la récupération post-chirurgicale.
Une xénogreffe qui guérit correctement va d’abord croûter, puis se rétablir dans les 50 jours suivant la chirurgie. Les greffons peuvent se contracter avec le temps, mais rester adhérents sur les bords où la peau du donneur rencontre la peau de la souris (Figure 2). Alors que l’écaillage du greffon devrait s’atténuer, les greffons resteront plus épais et plus enflammés que la peau humaine saine (Figure 2). Une contraction excessive des greffons peut se produire, réduisant les tissus disponibles pour l’analyse des critères d’évaluation. L’utilisation de greffons de taille constante et un placement approprié des greffons devraient atténuer ces problèmes. Tous les greffons au cours de cinq expériences indépendantes ont survécu jusqu’au moment de la récolte, jusqu’à 50 jours après la transplantation.
L’analyse tissulaire peut inclure l’immunohistochimie et les analyses unicellulaires après digestion enzymatique. Une partie de la peau a été traitée par digestion pendant la nuit dans 250 UI/mL de collagénase de type IV et 0,02 mg/mL de DNase dans des milieux de culture cellulaire (voir le tableau des matériaux), et colorée pour les marqueurs de surface et intracellulaires comme décrit précédemment14. L’analyse par cytométrie de flux a révélé la présence soutenue de cellules immunitaires humaines dans la plupart des greffons, mais le nombre variait entre les xénogreffes (Figure 3A). La figure 3B montre les résultats représentatifs d’une greffe réussie (à gauche) et d’une greffe qui n’a pas réussi à maintenir les cellules immunitaires humaines (à droite). L’analyse des coupes colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) prélevées au centre de la greffe a révélé une peau intacte et non dévitalisée composée de derme humain et d’épiderme pendant 35 et 50 jours (Figure 4).
Figure 1 : Méthode de bandage de la souris après la chirurgie. La souris est étroitement enveloppée dans de la gaze de vaseline et un pansement de film transparent sous anesthésie. (A) La gaze de vaseline est placée sur une surface légèrement plus grande que la plaie chirurgicale. (B) Le pansement transparent est préparé: une longue bande est coupée légèrement plus large que la gaze de vaseline. Le support recouvrant la face adhésive du pansement de film transparent est partiellement retiré. (C) Le côté adhésif du film est fermement pressé contre l’arrière de la souris, laissant un pouce d’espace sur l’extrémité avant du film. (D) La souris est tournée sur le dos. La partie avant en surplomb du film est pressée sur la souris et le support est retiré. (E) La souris est étroitement enveloppée dans le film et le support restant est retiré au fur et à mesure que la souris est enveloppée. (F) La souris est enveloppée avec succès dans le pansement, et ses bras et ses jambes ne sont pas contraints. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images représentatives d’animaux transplantés du jour 10 au jour 21 après la transplantation. (A-C) Trois souris différentes avec des greffes optimales au jour 10. (D-E) Deux souris différentes avec des greffes au jour 21. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Chimérisme des cellules immunitaires dans la peau greffée. Données de cytométrie en flux de la récupération des cellules immunitaires humaines à partir de xénogreffes. Les données sont fermées sur les événements de CD45+ de souris CD45+ humaine singulette, vivante. (A) Nombre de cellules (événements CD45+ humains vivants) récupérées à partir de deux expériences indépendantes. (B) Tracés représentatifs de la coloration des cellules immunitaires CD45+ humaines et de souris dans une greffe réussie (à gauche) par rapport à la greffe avec maintien infructueux du compartiment immunitaire humain (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Histologie de la peau humaine greffée aux jours 35 et 50. La peau greffée a été récoltée sur des souris au jour 35 (A) ou 50 (B), conservée dans 10% de formol et incorporée dans de la paraffine et colorée pour l’hématoxyline et l’éosine (H & E). (A) L’épiderme présente une hyperplasie modérée (acanthose), une légère hyper-granulose et une orthokératose compacte. Dans le derme papillaire, il y a parfois des capillaires dilatés et congestionnés. Les mélanocytes et le pigment de mélanine sont présents dans la couche basale de l’épiderme. Le derme est modérément cellulaire et est composé de fibroblastes ovales dodus avec cytoplasme syncytial pâle et lymphocytes dispersés. (B) L’épiderme comprend un épithélium pavimenteux stratifié, une orthokératose en panier dans la couche cornifiée et est d’épaisseur normale. Les mélanocytes et le pigment de mélanine sont présents dans la couche basale de l’épiderme. Le derme présente des fibroblastes ovales et un dépôt de matrice extracellulaire légèrement amélioré. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Chronologie du protocole adopté pour l’étude sur les xénogreffes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le modèle de greffe de peau de xénogreffe de souris est une technique clé pour disséquer mécaniquement les réponses immunitaires de la peau humaine dans un contexte in vivo 14. Le succès des greffes de xénogreffes cutanées repose sur une préparation appropriée de souris et d’échantillons de peau et de souris et sur l’adhésion aux méthodes de chirurgie aseptique des rongeurs15. Un refroidissement rapide et un entreposage approprié des échantillons de peau à basse température dans des milieux (tels qu’une solution saline stérile) sont importants pour assurer la santé continue des tissus avant la transplantation12. La collecte d’échantillons d’épaisseur fendue, à l’aide d’un instrument tel qu’un dermatome, permet d’uniformiser la profondeur de l’échantillon entre les souris et augmente l’apport de nutriments de l’hôte pour améliorer la survie du greffon10. Une perte d’intégrité du greffon avec desquamation épidermique peut être observée, en particulier dans les greffons de pleine épaisseur avec apport sanguin perturbé16. La survie des souris pendant et après la chirurgie est facilitée par une technique stérile, un apport de chaleur pendant et après la chirurgie et des techniques qui minimisent le temps chirurgical, telles que l’utilisation de colle chirurgicale15. L’administration d’anti-GR1 après greffe permet de supprimer les réponses immunitaires restantes de la souris chez l’hôte immunodéficient afin de favoriser la survie du greffon10. Ces méthodes augmentent la probabilité de survie de la souris et du greffon pendant le modèle de greffe de xénogreffe et améliorent les nombres expérimentaux et la reproductibilité d’une expérience à l’autre.
Bien qu’extrêmement utile, le modèle de greffe de peau de xénogreffe présente certaines limites clés, comme cela a été démontré. Premièrement, la greffe existe dans un environnement inflammatoire, très probablement secondaire à une ischémie transitoire et à une infiltration de tissu greffé humain avec des cellules myéloïdes murines. Ainsi, il ne reflète pas la peau humaine à l’état d’équilibre et peut ne pas refléter pleinement toutes les maladies inflammatoires de la peau humaine10,14. L’étude des troubles inflammatoires humains en greffant des biopsies cliniques à partir de peau lésionnelle est une stratégie alternative, mais les limites du nombre de biopsies disponibles et le contrôle incohérent de la profondeur de greffe rendent cette option moins favorable. De plus, les greffes de xénogreffe ne récapitulent pas l’architecture immunitaire périphérique humaine. La reconstitution de la périphérie de la souris avec des cellules humaines peut également comporter des mises en garde, car la structure lymphoïde de la souris NSG est atrophique avant la greffe de cellules humaines; Cela peut conduire à une sélection préférentielle des cellules dans certains contextes10,17. De plus, la greffe de peau et la récupération des cellules immunitaires à partir d’échantillons de peau peuvent varier d’une souris à l’autre, même en l’absence de traitement. Au moins 10 répétitions par condition sont recommandées pour ce modèle afin d’observer des différences cohérentes entre les groupes. La durée appropriée du test peut devoir être ajustée pour la question expérimentale, car la cicatrisation et la revascularisation du greffon se produisent au cours des premières semaines suivant la greffe, et l’effet des interventions peut dépendre du stade de la greffe.
Malgré ces inconvénients, le modèle de greffe de peau de xénogreffe humaine reste l’un des rares tests à étudier les réponses immunitaires de la peau humaine dans l’organe intact in vivo. Bien que les modèles murins transgéniques puissent permettre la dissection des voies mécanistes, les différences d’anatomie, de composition des cellules immunitaires et de voies immunitaires dominantes limitent la traduction en maladie humaine1. La culture ex vivo de cellules dérivées de l’homme, de modèles organoïdes cutanés et d’études d’explantation de tissus humains peuvent être utilisées de manière alternative, mais sont également sujettes à des limitations, y compris la perturbation des réseaux de cellules immunitaires et la sortie des cellules immunitaires du tissu intact18,19. Par conséquent, les modèles de greffe de peau de xénogreffe restent une méthode clé pour étudier les candidats thérapeutiques et les réponses cutanées humaines à l’inflammation dans un cadre préclinique in vivo.
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Disclosures
MDR est l’un des fondateurs de TRex Bio et Sitryx. MDR et MML reçoivent des fonds de recherche de Sitryx, Q32 et TRex Bio.
Acknowledgments
Ce travail a été financé en partie par des accords de recherche parrainés par TRex Bio et des subventions des NIH (1R01AR075864-01A1). JMM est soutenu par la Société de recherche sur le cancer (subvention 26005). Nous reconnaissons le noyau de cytométrie en flux Parnassus soutenu en partie par les subventions NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 et S10 1S10OD018040-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
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