Summary
El conjunto estructural de la alfa-sinucleína monomérica afecta su función fisiológica y sus propiedades fisicoquímicas. El presente protocolo describe cómo realizar espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio de milisegundos y análisis de datos posteriores para determinar información conformacional sobre el monómero de esta proteína intrínsecamente desordenada en condiciones fisiológicas.
Abstract
La alfa-sinucleína (aSyn) es una proteína intrínsecamente desordenada cuyos agregados fibrilares son abundantes en los cuerpos de Lewy y las neuritas, que son las características distintivas de la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, gran parte de su actividad biológica, así como su agregación, involucra centralmente la forma de monómero soluble de la proteína. La elucidación de los mecanismos moleculares de la biología y fisiopatología de aSyn requiere métodos estructuralmente altamente resueltos y es sensible a las condiciones biológicas. Sus estructuras metaestables desplegadas de forma nativa hacen que el aSyn monomérico sea intratable para muchas técnicas de biología estructural. Aquí, se describe la aplicación de uno de estos enfoques: espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno / deuterio (HDX-MS) en la escala de tiempo de milisegundos para el estudio de proteínas con baja estabilidad termodinámica y factores de protección débiles, como aSyn. En la escala de tiempo de milisegundos, los datos de HDX-MS contienen información sobre la accesibilidad al disolvente y la estructura unida al hidrógeno de aSyn, que se pierden en tiempos de etiquetado más largos, lo que en última instancia produce una resolución estructural hasta el nivel de aminoácidos. Por lo tanto, HDX-MS puede proporcionar información a altas resoluciones estructurales y temporales sobre dinámica conformacional y termodinámica, interacciones intra e intermoleculares, y el impacto estructural de mutaciones o alteraciones en las condiciones ambientales. Si bien es ampliamente aplicable, se demuestra cómo adquirir, analizar e interpretar mediciones de HDX-MS de milisegundos en aSyn monomérica.
Introduction
La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a millones de personas en todo el mundo1. Se caracteriza por la formación de inclusiones citoplasmáticas conocidas como cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy en la región de la sustancia negra pars compacta del cerebro. Se ha encontrado que estas inclusiones citoplasmáticas contienen agregados de la proteína intrínsecamente desordenada aSyn2. En la EP y otras sinucleinopatías, aSyn se transforma de un estado desordenado soluble en un estado enfermo insoluble y altamente estructurado. En su forma nativa, aSyn monomérico adopta una amplia gama de conformaciones estabilizadas por interacciones electrostáticas de largo alcance entre su N- y C-termini e interacciones hidrofóbicas entre su región C-terminal y el componente beta no amiloide (NAC) 3,4,5,6. Cualquier interrupción en esas interacciones estabilizadoras, como mutaciones, modificaciones post-traduccionales y cambios en el entorno local, puede conducir al plegamiento incorrecto del monómero, desencadenando así el proceso de agregación7.
Si bien existe una gran cantidad de investigación sobre las formas oligomérica y fibrilar de aSyn 8,9,10,11, existe una necesidad crucial de estudiar la forma monomérica de la proteína y comprender mejor qué conformadores son funcionales (y cómo) y cuáles son propensos a agregar 8,9,10,11 . Al ser intrínsecamente desordenado, de solo 14 kDa de tamaño y difícil de cristalizar, el monómero aSyn no es susceptible a la mayoría de las técnicas biológicas estructurales. Sin embargo, una técnica capaz de medir la dinámica conformacional de aSyn monomérico es el HDX-MS de milisegundos, que recientemente ha generado importantes observaciones estructurales que serían desafiantes o imposibles de obtener de otra manera 12,13,14. Millisegundo HDX-MS mide sensiblemente el promedio del conjunto conformacional de proteínas mediante el monitoreo del intercambio isotópico en hidrógenos amida, lo que indica la accesibilidad al solvente y la participación en la red de enlace de hidrógeno de una región proteica particular en la escala de tiempo de milisegundos. Es necesario enfatizar el aspecto de milisegundos del HDX-MS ya que, debido a su naturaleza metaestable y desplegada de forma nativa, aSyn exhibe una cinética de intercambio de hidrógeno muy rápida que se manifiesta muy por debajo del límite inferior de los sistemas HDX-MS convencionales. Por ejemplo, la mayor parte de la molécula aSyn ha intercambiado completamente hidrógeno por deuterio en condiciones intracelulares en menos de 1 s. Varios laboratorios han construido instrumentación de mezcla rápida; en este caso, se utiliza un prototipo de instrumento de flujo de enfriamiento de mezcla rápida capaz de realizar HDX-MS con un tiempo muerto de 50 ms y una resolución temporal de 1 ms15. Si bien HDX-MS de milisegundos ha sido recientemente muy importante en el estudio de aSyn, puede ser valioso para estudiar proteínas / regiones intrínsecamente desordenadas más ampliamente y una gran cantidad de proteínas con asas / regiones que solo son débilmente estables. Por ejemplo, medicamentos peptídicos (por ejemplo, insulina; GLP-1/glucagón; tirzepatida) y las proteínas de fusión peptídica (por ejemplo, el inhibidor del VIH FN3-L35-T1144) son los principales formatos de fármacos en los que la información estructural y de estabilidad en fase de solución puede ser un insumo crítico para las decisiones de desarrollo de fármacos y, sin embargo, la fracción peptídica a menudo solo es débilmente estable e intratable por HDX-MS en la escala de tiempo de segundos 16,17,18,19,20 . Se ha demostrado que los métodos emergentes HDX-MS con etiquetado en los dominios de segundos/minutos derivan información estructural para los G-cuadrúplex de ADN, pero debería ser posible extender esto a estructuras de oligonucleótidos más diversas mediante la aplicación de HDX-MS21 de milisegundos.
Los experimentos hdX-MS se pueden realizar en tres niveles diferentes: (1) de abajo hacia arriba (por lo que la proteína marcada se digiere proteolíticamente), (2) de medio hacia abajo (por lo que la proteína marcada se digiere proteolíticamente y los péptidos resultantes se fragmentan aún más mediante técnicas de fragmentación suave) y (3) de arriba hacia abajo (mediante la cual las técnicas de fragmentación suave fragmentan directamente la proteína marcada)22 . Por lo tanto, los datos submoleculares de HDX-MS nos permiten localizar el comportamiento de intercambio a regiones específicas de una proteína, por lo que es fundamental tener una cobertura de secuencia adecuada para tales experimentos. La resolución estructural de cualquier experimento HDX-MS se basa en el número de péptidos proteolíticos o fragmentos derivados de la proteína en la digestión o la fragmentación suave, respectivamente. En cada uno de los tres tipos de experimentos descritos anteriormente, el cambio en el intercambio de amida en cada péptido / fragmento se mapea de nuevo en la estructura primaria de la proteína para indicar el comportamiento de las regiones localizadas de la proteína. Si bien la resolución estructural más alta se logra a través de la fragmentación suave, la descripción de estos experimentos está fuera del alcance del estudio actual, que se centra en la medición de conformaciones de monómeros aSyn. Se pueden obtener excelentes resultados con el flujo de trabajo "de abajo hacia arriba" comúnmente aplicado que se describe aquí.
Aquí, se proporcionan procedimientos sobre (1) cómo preparar y manejar muestras de aSyn y búferes HDX-MS, (2) cómo realizar el mapeo de péptidos para un experimento HDX-MS de abajo hacia arriba, (3) cómo adquirir datos HDX-MS en aSyn monomérico en condiciones fisiológicas, específicamente en el dominio del tiempo de milisegundos (utilizando un instrumento personalizado; también se han descrito instrumentos alternativos para el etiquetado de milisegundos), y (4) cómo procesar y analizar los datos de HDX-MS. Los métodos que utilizan aSyn monomérico a pH fisiológico (7.40) en dos condiciones de solución se ejemplifican aquí. Si bien son críticamente útiles en el estudio de aSyn, estos procedimientos se pueden aplicar a cualquier proteína y no se limitan a proteínas intrínsecamente desordenadas.
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Protocol
1. Expresión proteica y purificación de aSyn
- Prepare aSyn siguiendo un informe publicado anteriormente9.
- Dializar en un tampón de almacenamiento seguro (por ejemplo, Tris, pH 7.2 ).
- Si es necesario, concentre la muestra (por ejemplo, tubos de microcentrífuga de filtro de espín utilizando 3 kDa MWCO, 14,000 x g durante aproximadamente 10-30 min, consulte la Tabla de materiales).
NOTA: Se aconseja no concentrarse excesivamente. La integridad del conjunto de monómeros no se ha verificado más allá de 25 μM. - Alícuota y conservación a −80 °C
NOTA: La proteína monómero aSyn es estable hasta por 1 año en estas condiciones de almacenamiento.
2. Preparación del búfer HDX
NOTA: Dado que Tris tiene un coeficiente de temperatura alto, la medición del pH debe ajustarse para la temperatura a la que se realizará la reacción HDX, que es de 20 ° C en este protocolo.
- Prepare el amortiguador de equilibrio para el Estado A y el Estado B pesando 0.002 mol de Tris en 100 ml de agua de grado LC-MS. Para el Estado B, agregue 29.8 mg de KCl, 14.2 mg de MgCl2, 36.8 g de CaCl2 y 836 mg de NaCl al tampón Tris. Ajuste el pH a 7.40 ± 0.05.
NOTA: El tampón de equilibrio debe contener las condiciones en las que se va a estudiar aSyn. En este caso, es de 20 mM Tris a pH 7.4 +/− sales. - Prepare el tampón de etiquetado para el Estado A y el Estado B pesando 0.002 mol de Tris en 100 ml de agua deuterada. Para el Estado B, agregue 29.8 mg de KCl, 14.2 mg de MgCl2, 36.8 g de CaCl2 y 836 mg de NaCl al tampón de etiquetado Tris. El pD del tampón de etiquetado corresponde al pH del tampón de equilibrio. Dado que pH = pD - 0.41, ajuste para que el medidor de pH lea 6.99 ± 0.0523,24.
NOTA: El tampón de etiquetado debe tener los mismos componentes que el tampón de equilibrio, excepto que se prepara con agua deuterada. - Prepare el tampón de enfriamiento pesando 0.010 mol de Tris y 0.050 mol de urea y haga hasta 100 ml con agua de grado LC-MS. Ajuste el pH a 2.50 ± 0.05 a 0.5 ° C.
NOTA: Se debe realizar una pantalla de búfer de enfriamiento antes de los experimentos HDX para identificar el mejor búfer de enfriamiento para la proteína de interés. Se examinan diferentes concentraciones y combinaciones de desnaturalizantes (por ejemplo, clorhidrato de urea y guanidinio) y agentes reductores (por ejemplo, tris(2-carboximetil)fosfina), junto con parámetros físicos como el volumen de captura y la temperatura, para desplegar y digerir eficazmente la proteína apagada. Un tampón de enfriamiento que comprende 100 mM Tris y 0.5 M de urea a pH 2.50 es óptimo para el presente estudio. - Prepare el tampón de lavado de la columna de digestión pesando 0.125 mol de clorhidrato de guanidinio en una botella de vidrio Duran. Añadir 25 ml de metanol y 250 μL de ácido fórmico. Enfríe hasta 250 ml con agua de grado LC-MS.
NOTA: Para la columna de pepsina Enzymate BEH (consulte la Tabla de materiales), use un tampón de lavado de columna de 0.5 M de clorhidrato de guanidinio, 10% (v / v) de metanol y 0.1% (v / v) de ácido fórmico. - Prepare el lavado débil de la jeringa pipeteando 0.5 μL de ácido fórmico en 249.5 mL de agua de grado LC-MS.
- Prepare el lavado fuerte de la jeringa mezclando partes iguales de agua de grado LC-MS, metanol, acetonitrilo e isopropanol. Agregue ácido fórmico a una concentración final de 2% (v / v).
NOTA: Para evitar la contaminación cruzada entre los diversos tampones y la proteína y para permitir la limpieza del puerto de inyección, es fundamental que se preparen soluciones de lavado de jeringas y que la ruta de flujo a la válvula (a menudo llamada "forro de lavado") esté completamente cebada con líquido. El ácido fórmico es opcional para el lavado débil de la jeringa.
3. Procedimiento de mapeo de péptidos
- Prepare el ejemplo siguiendo el paso siguiente.
- Filtro descongelado aSyn protein stock del congelador de -80 °C con filtros de jeringa de 0,22 μm. Mida la absorbancia de la proteína madre filtrada a 280 nm para determinar la concentración según la ley de Beer-Lambert. Diluir la proteína a una concentración de 5 μM en el tampón de equilibrio (paso 2.1.).
NOTA: La ley de Beer-Lambert: A = εcl, donde A es absorbancia, ε es el coeficiente de extinción de la proteína en la longitud de onda medida (280 nm aquí) con unidades M−1cm−1, c es la concentración de proteína en M, y l es la longitud de la trayectoria en cm. Para aSyn26 de tipo salvaje, ε = 5960 M−1cm−1.
- Filtro descongelado aSyn protein stock del congelador de -80 °C con filtros de jeringa de 0,22 μm. Mida la absorbancia de la proteína madre filtrada a 280 nm para determinar la concentración según la ley de Beer-Lambert. Diluir la proteína a una concentración de 5 μM en el tampón de equilibrio (paso 2.1.).
- Configure el método de cromatografía líquida.
- Cree un archivo de entrada con un tiempo de carga / captura de 3 min a una presión de 7000-9000 psi, seguido de un gradiente de 5% de acetonitrilo a 40% de acetonitrilo en 7 min, seguido de pasos de lavado repetidos de 5% -95% de acetonitrilo-agua durante 10 min.
- Asegúrese de que el spray de bloqueo (por ejemplo, leucina encefalina, consulte la Tabla de materiales) fluya a 2000 psi y esté conectado a la sonda de pulverización de bloqueo de fuente del espectrómetro de masas.
- Configure los métodos MSE de espectrometría de masas.
NOTA: MSE es un método de adquisición independiente de los datos de banda ancha sin aislamiento masivo de precursores. Por lo tanto, todos los iones dentro del rango m/z seleccionado se fragmentan aún más mediante disociación inducida por colisión (CID)27.- En el archivo de método MS, elija MSE Continuum y configure un tiempo de adquisición entre 2-10 min, fuente de electrospray y modo de resolución positiva. Adquirir MSE sobre 50-2000 Da, escaneando cada 0.3 s.
- Para la función 1 (baja energía), configure la trampa y transfiera las energías de colisión para que sean de 4 V. Para la función 2 (alta energía), configure la energía de colisión de transferencia de rampa para que sea constante a 4V y la energía de colisión de trampa para que sea como se indica en la Tabla 1 para cada nivel de energía de mapeo.
NOTA: También se pueden utilizar métodos MSE de movilidad iónica. Se pueden utilizar métodos alternativos de mapeo (por ejemplo, adquisición dependiente de datos o DDA) a discreción del usuario.
- Configure el robot de muestreo automático (consulte la Tabla de materiales).
- Añadir 50 μL de la proteína de 5 μM a un vial de recuperación total. Coloque el vial en una posición de muestra en la cámara derecha de HDX. Asegúrese de que esta cámara esté a 0,5 °C.
- Agregue un vial de reactivo de tampón de equilibrio y dos viales de reactivo de tampón de etiquetado a las posiciones de reactivo uno, dos y tres en la cámara izquierda de HDX. Asegúrese de que esta cámara esté a 20 °C ajustando el controlador de temperatura Peltier (consulte la Tabla de materiales). Agregue un vial de reactivo de tampón de enfriamiento a la posición uno del reactivo en la cámara derecha HDX.
- Añadir ocho viales de recuperación total en las posiciones de reacción de la cámara izquierda HDX y ocho viales de recuperación máxima en las posiciones de reacción de la cámara derecha HDX.
NOTA: Para garantizar una limpieza completa y la máxima reproducibilidad de los volúmenes dispensados, se recomienda realizar un lavado de jeringa y un lavado primario en las jeringas de automuestreador. Por ejemplo, ejecute una secuencia de (1) lavado débil, (2) lavado fuerte, (3) lavado débil antes de comenzar los experimentos de mapeo. Esta secuencia se puede repetir ampliamente, y se recomienda hacerlo hasta 20 veces o hasta que la jeringa esté completamente mojada. - Configure una lista de ejemplo con los métodos LC y MS apropiados en el software de programación e inicie la programación.
NOTA: Para el presente estudio, Chronos se utiliza como software de programación (ver Tabla de Materiales).
- Procese los datos de mapeo.
- Identifique los péptidos de los archivos del experimento de mapeo utilizando el software apropiado (consulte la Tabla de materiales).
- Importe datos de identificación de péptidos en DynamX (consulte la Tabla de materiales) utilizando los siguientes parámetros de umbral de péptidos: intensidad mínima = 5000, longitud mínima de secuencia = 0, longitud máxima de secuencia = 40, productos mínimos = 1, productos mínimos por aminoácido = 0,25, productos consecutivos mínimos = 2, intensidad de suma mínima para productos = 0, puntuación mínima = 0 y error MH+ máximo (ppm) = 0.
NOTA: Alternativamente, derive la configuración optimizada de acuerdo con un flujo de trabajo recomendado28. - Seleccione Datos en el menú y haga clic en Importar resultados de PLGS. Haga clic en Agregar para elegir los archivos de datos relevantes para la asignación espectral. Cuando se hayan agregado todos, haga clic en Siguiente e ingrese la configuración del filtro anterior. Luego, haga clic en Finalizar.
- Seleccionar manualmente las asignaciones isotópicas para obtener el mapa final de cobertura peptídica de aSyn en DynamX.
4. Estudio de intercambio de hidrógeno/deuterio de milisegundos
- Limpie el prototipo de instrumento FastHDX (consulte la Tabla de materiales) antes de iniciar los experimentos HDX.
- Abra la GUI de software HDX compatible y permita que el sistema se inicialice.
- Introduzca la temperatura de la cámara de muestra como 20 °C y la cámara de enfriamiento como 0,5 °C. Haga clic en Establecer para aplicar las nuevas temperaturas.
- Instale los tubos de la centrífuga con agua de grado LC-MS en todas las entradas.
- En la pestaña Entrega de plomería del valorador , verifique las jeringas izquierda y derecha y haga clic en Prime para eliminar cualquier burbuja de aire latente en los tubos. Repita hasta que todas las burbujas se hayan ido.
- En la pestaña Macros , marque todas las casillas de las jeringas. Haga clic en Calibrar jeringas Posición de inicio. Haga clic en Wash Syringe Load Loop. Haga clic en Lavar todos los volúmenes del bucle de mezcla.
- Repita el paso 4.1.5. 1x más.
- Si aparece alguna burbuja en las jeringas tampón, desgasifique desconectando la jeringa y expulsando la burbuja verticalmente. Reemplace la jeringa y recalibre a la posición cero.
- Configure el prototipo de instrumento FastHDX para experimentos HDX.
- Agregue 500 uL de aSyn filtrado de 5 μM en un vial de recuperación total y colóquelo dentro de un refrigerador de mesa para evitar la oligomerización y agregación inducidas por la temperatura.
- Agregue 50 ml de búferes de equilibrio, etiquetado y enfriamiento a cada búfer (2. Pasos de preparación del búfer HDX 1-3) entrada en las cámaras izquierda y derecha.
- Añadir 50 ml de tampón de lavado de columna (2. HDX buffer preparación paso 4) a la entrada de lavado de pepsina.
- Para cebar las líneas de lavado de proteínas y columnas 1x, verifique las jeringas izquierda y derecha en la pestaña Entrega de plomería del valorador y haga clic en Prime una vez.
NOTA: Cualquier clic posterior en Prime causará repeticiones adicionales del proceso de prime, lo que resultará en el consumo de grandes cantidades de muestra de proteína. Se recomienda tener cuidado para evitar esto, incluso cuando hay un retraso en el software después de que se haya intentado hacer clic en un botón. - Repita los pasos 4.1.5. 1x.
- En la ficha Flujo de enfriamiento manual , introduzca la configuración necesaria, que se explica en los pasos 4.2.7.-4.2.10.
- Para un experimento de curso de tiempo, ingrese los tiempos en milisegundos usando el botón Puntos simbólicos . Si se requieren réplicas, agregue el mismo punto de tiempo varias veces, por ejemplo, para un triplicado de 50 ms, se debe ingresar 50 50 50. La lista de muestra en el software del espectrómetro de masas (MassLynx se utiliza aquí, consulte la Tabla de materiales) debe coincidir exactamente con esos puntos de tiempo.
NOTA: Los nombres de archivo de la lista de muestra del espectrómetro de masas y / o el texto de muestra deben usarse para garantizar un registro permanente de los tiempos de etiquetado HDX correspondientes a los ingresados en la GUI del software FastHDX. Los tiempos de etiquetado para cada ejecución de muestra no se almacenarán en ningún otro lugar. - Establezca el tiempo de captura (minutos) como la duración del tiempo de captura. Aquí, son las 3.00.
- Establezca Wait for HPLC (mins) = (tiempo de captura + tiempo de ejecución + 1,5 min)..
NOTA: Por ejemplo, para un experimento con 3 minutos de captura y 17 minutos de gradiente, esto será 21.50 min. - Haga clic en el cuadro Ejecutar en blanco solo si ejecuta experimentos en blanco entre ejecuciones de ejemplo. En caso afirmativo, asegúrese de una entrada (es decir, una fila válida en la lista de ejemplo) en el software para la ejecución en blanco después de cada ejecución de muestra.
- Una vez que la lista de muestra esté lista en el software, resalte las entradas apropiadas e inicie la ejecución en el software haciendo clic en el botón Reproducir y FastHDX en el software.
NOTA: Debido a la lucha de hidrógeno / deuterio, los métodos de solo EM o técnicas de fragmentación suave (disociación por transferencia de electrones, disociación por captura de electrones y fotodisociación ultravioleta) solo se pueden usar29. Para aSyn a un pH fisiológico de 7.40, los puntos de tiempo que van desde 50 ms a 300 s son los más aplicables, ya que cubren toda la curva de absorción de deuterio8.
5. Tratamiento de datos
- Cargue el archivo de péptidos asignados espectralmente de los experimentos de mapeo de péptidos. Abra el menú Archivo y haga clic en Abrir en el software DynamX (consulte la Tabla de materiales).
- Importe archivos sin procesar en el software de medición de masa preferido (por ejemplo, DynamX, HDExaminer, etc.). Abra el menú "Datos" y haga clic en MS Files. Haga clic en Nuevo estado para crear estados para cada condición de proteína estudiada.
- Haga clic en Nueva exposición para agregar cada punto de tiempo HDX. Haga clic en Nuevo RAW para importar los archivos .raw. Arrastre cada archivo .raw a la posición correcta. Haga clic en Aceptar cuando haya terminado.
- Asigne isótopos automáticamente primero (esto es automático siguiendo el paso 5.2. anterior), luego seleccione manualmente la asignación isotópica para garantizar una alta calidad de los datos.
- Exporte los datos del clúster a un archivo .csv con columnas en el siguiente orden: nombre de proteína, número de inicio de secuencia, número de fin de secuencia, secuencia, modificación, fragmento, absorción máxima posible, masa de especies monoisotópicas, nombre de estado, tiempo de exposición, nombre de archivo, carga, tiempo de retención, intensidad y centroide.
- Abra el menú Datos en el software de medición masiva y haga clic en Exportar datos de clúster.
6. Análisis de datos
- Cargue los datos de clúster exportados en el software de análisis HDX preferido. Aquí, HDfleX se utiliza30 (ver Tabla de Materiales).
- Ajuste los datos experimentales para todos los péptidos y estados, seleccionando los métodos de corrección de intercambio posterior apropiados para obtener las constantes de velocidad observadas para la reacción HDX.
- Calcule un umbral de significancia global por el método preferido (HDfleX admite varias opciones para esto) y realice pruebas de significación híbridas para determinar las diferencias significativas entre los estados en comparación con31,32.
NOTA: Si la diferencia observada es mayor que el umbral global y el valor p es menor que el nivel de confianza elegido (por ejemplo, 95%), la diferencia se considera significativa.
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Representative Results
Debido a su naturaleza intrínsecamente desordenada, es difícil capturar los intrincados cambios estructurales en aSyn a pH fisiológico. HDX-MS monitorea el intercambio isotópico en los hidrógenos de amida de la columna vertebral, sondeando la dinámica e interacciones conformacionales de las proteínas. Es una de las pocas técnicas para adquirir esta información a altas resoluciones estructurales y temporales. Este protocolo es ampliamente aplicable a una amplia gama de proteínas y condiciones tampón, y esto se ejemplifica con la medición de la cinética de intercambio de aSyn en dos condiciones de solución diferentes: Estado A y Estado B8, como se define en los pasos 2.1.-2.2.
En primer lugar, se realizó un experimento de mapeo en aSyn y se obtuvo un mapa de cobertura peptídica, como se muestra en la Figura 1. El mapa cubre el 100% de la secuencia de proteínas y tiene una redundancia media de 3,79. El valor de cobertura del 100% indica que todos los aminoácidos en la proteína se encontraron en los digestos de proteínas y permitirá un análisis exhaustivo del comportamiento de intercambio de aSyn. El valor de redundancia indica el número de péptidos superpuestos. Un valor de redundancia más alto aumenta la resolución estructural del mapa final, dado el aplanamiento sustractivo de los datos para péptidos superpuestos32.
Utilizando el prototipo de instrumento de flujo de enfriamiento de mezcla rápida (consulte la Tabla de materiales), se recopilaron datos HDX-MS de escala de tiempo de milisegundos de alta calidad en aSyn a pH 7.4 en el Estado A y el Estado B (Figura 2). Después de una asignación isotópica en DynamX, se obtuvieron curvas de captación de deuterio "crudo", como se muestra en la Figura 3A. Muestra curvas de absorción para tres péptidos seleccionados en cada dominio proteico. Se muestra la incorporación de deuterio a lo largo del tiempo. El eje x está en la escala de tiempo de milisegundos, que se alinea con la cinética muy rápida de aSyn en condiciones fisiológicas. La región sombreada en rojo muestra los datos obtenidos típicamente de los instrumentos HDX convencionales, con mediciones iniciales a partir de 30 s. Es importante destacar que esto no puede reducirse aún más mediante la manipulación del pH para la llamada "expansión de la ventana de tiempo"; ese enfoque no es válido para el estudio de proteínas/regiones intrínsecamente desordenadas, ya que el cambio de pH perturbará el conjunto conformacional del polipéptido débilmente estable. Como se puede ver aquí, la mayor parte de aSyn se intercambia completamente por 1 s (Figura 3C). Esto muestra la importancia de las mediciones hdX de milisegundos para aSyn monomérico a medida que se captura la curva de captación cinética completa para la reacción de intercambio, lo que produce la medición más precisa de las conformaciones del monómero.
HDfleX realizó la corrección de back-exchange utilizando la incorporación de deuterio de meseta. Los puntos de datos se ajustaron posteriormente de acuerdo con la Ecuación 1, proporcionando una constante de velocidad observada, kobs, indicativa de la accesibilidad al disolvente y la participación del enlace de hidrógeno de ese péptido en particular (Figura 3B).
Ecuación 1
donde Dt es la incorporación de deuterio en el tiempo t, nExp es el número de fases exponenciales, N es el número máximo de hidrógenos lábiles, kobs es la constante de tipo de cambio observada y β es un factor de estiramiento30,33.
Después del ajuste de la curva, el área de captación debajo de la curva ajustada se puede calcular integrando la función ajustada que describe la curva de captación dentro de la ventana de tiempo experimental. Se realizaron análisis de significación estadística entre el área de captación de los dos estados. En primer lugar, se calculó un umbral de significación global para el área de captación en HDfleX a un nivel de confianza del 95%. Luego se generaron gráficos de diferencia de área de captación, que muestran la diferencia entre el Estado A y el Estado B en dos niveles de resolución estructural: resolución peptídica (Figura 4A) y resolución de aminoácidos (Figura 4B). La gráfica de diferencia de resolución de péptidos muestra la diferencia en el área de absorción entre el Estado A y el Estado B para cada péptido individual, mientras que la gráfica de diferencia de resolución de aminoácidos muestra la diferencia en el área de absorción entre el Estado A y el Estado B aplanada en toda la secuencia de aminoácidos de aSyn30,34. Ambas gráficas indican una mayor absorción general de deuterio en todo el monómero aSyn en el Estado B en comparación con el Estado A. Este hallazgo puede justificarse examinando las gráficas de captación de deuterio en la Figura 3, donde la curva de captación del Estado B está siempre por encima de la curva de captación del Estado A. Además, se puede ver que la magnitud de la diferencia de área de absorción es mucho mayor en el extremo C. Una vez más, esto se puede justificar rastreando hasta las curvas de absorción originales, donde los péptidos C-terminales (péptidos 124-140 que se muestran en la Figura 3) muestran una brecha mucho mayor entre las curvas de absorción que el resto de la proteína. En conclusión, las condiciones de solución en el Estado B causan un aumento en la exposición al solvente o una disminución en la participación de la red de enlace de hidrógeno en toda la proteína, pero más aún en el extremo C.
Figura 1: Mapa de cobertura de péptidos de aSyn de tipo salvaje con un total de 30 péptidos y una cobertura de secuencia del 100%. Los tres dominios de aSyn se destacan de la siguiente manera: N-terminal (azul), región de componente beta no amiloide (amarillo) y C-terminal (rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Flujo de trabajo para un experimento HDX-MS de milisegundos en aSyn. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplos de gráficos de captación de tres péptidos seleccionados en los tres dominios de aSyn para el Estado A (amarillo) y el Estado B (azul). (A) Gráfico de absorción corregido no apto y no de intercambio de respaldo. (B) Parcelas de captación corregidas ajustadas y de intercambio de respaldo. La región sombreada en rojo representa los datos que pueden obtener los sistemas HDX-MS convencionales, que normalmente comienzan a partir de los 30 s. Las barras de error corresponden a la desviación estándar de las tres réplicas. (C) Gráfico de mapa de calor del porcentaje de absorción de deuterio a través de la secuencia de aminoácidos por punto de tiempo. La barra de color representa el porcentaje de absorción de deuterio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Gráficos de diferencia de área de absorción en el tiempo máximo de meseta de la curva (14.084 ms). (A) Los gráficos de resolución de residuos de péptidos muestran la diferencia de área de absorción de cada péptido entre el estado A y el estado B. (B) Gráfico de resolución de aminoácidos que muestra la diferencia de área de absorción entre el estado A y el estado B aplanado a través de la secuencia de aminoácidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Mapeo del nivel de energía | Voltaje de rampa (V) |
| Bajo | 20-40 |
| Medio | 25-45 |
| Alto | 30-50 |
| Muy alto | 35-55 |
Tabla 1: Mapeo de los niveles de energía y los voltajes de rampa de transferencia correspondientes.
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Discussion
En el presente artículo, se describen los siguientes procedimientos: (1) realizar experimentos de mapeo de péptidos en aSyn monomérico para obtener la mayor cobertura de secuencia, (2) adquirir datos de HDX-MS de milisegundos en aSyn monomérico en condiciones fisiológicas, y (3) realizar análisis de datos e interpretación de los datos hdX-MS resultantes. Los procedimientos proporcionados son generalmente fáciles de ejecutar, cada experimento de etiquetado generalmente dura solo alrededor de 8 h para tres réplicas y ocho puntos de tiempo, y el experimento de mapeo dura solo alrededor de 2 h. Dada la instrumentación totalmente automatizada utilizada aquí, se puede adquirir un conjunto de datos completo en 1 día. Sin embargo, al manipular muestras y preparar tampones, se debe tener cuidado para garantizar que las mediciones se deriven de proteínas débilmente estables (o regiones de proteínas) en el estado deseado. Es importante destacar que un estudio anterior mostró que las diferentes condiciones de almacenamiento, como la congelación y la liofilización, dieron como resultado diferentes conformadores de monómeros aSyn y que es importante caracterizar el impacto potencial del manejo de muestras en el conjunto conformacional de monómeros aSyn10. De hecho, HDX-MS es una medida altamente sensible de tales perturbaciones conformacionales, con un rango dinámico de microsegundos a al menos meses. Además, si se estudia estrictamente solo el monómero aSyn, se recomienda encarecidamente la filtración para eliminar los oligómeros y fibrillas no deseados que podrían haberse formado en la muestra durante el almacenamiento o la manipulación. Además, los búferes HDX-MS deben controlarse estrictamente dentro de 0.05 del pH o pD deseado, ya que cualquier discrepancia afectará significativamente la tasa de cambio intrínseca y conducirá a errores no deseados. También es importante tener en cuenta que las comparaciones entre las condiciones de la solución para cualquier proteína que difiera en pH, temperatura o composición de sal alterarán la tasa intrínseca. Por lo tanto, estos datos requerirán correcciones adicionales, como la aplicación de un factor de ajuste de pH35 o un factor de corrección empírica 8,30.
En términos de instrumentación, no existen sistemas disponibles comercialmente que permitan la adquisición de datos HDX-MS de milisegundos. Varios grupos de investigación han desarrollado sus propios sistemas, desde sistemas de flujo de enfriamiento 13,15,36 hasta chips microfluídicos 37,38,39 para capturar la cinética de intercambio rápido de ciertas proteínas. Otro método que se ha utilizado para lograr datos HDX-MS de escala de tiempo de milisegundos se conoce como el método de expansión de tiempo 40,41, por el cual el pH de los búferes se reduce para ralentizar la cinética de intercambio. Sin embargo, este método no se aplica a aSyn (o a cualquier característica de proteína débilmente estable) ya que (1) la disminución del pH cambia drásticamente la densidad de carga de la proteína y aumenta la tasa de agregación 8,42, y (2) los conformadores de aSyn son solo metaestables y es probable que se vean perturbados por estas alteraciones del pH. Por estas razones, se recomienda mantener un pH consistente en los tampones HDX-MS cuando se estudian conformaciones monoméricas de aSyn, a menos que sea fisiológicamente relevante, y emplear un instrumento de etiquetado de milisegundos.
La mayor parte del monómero de aSyn se intercambia completamente dentro de 1 s, y como máximo, se necesitan aproximadamente 15 s para intercambiar completamente con el deuterio (Figura 3) a un pH fisiológicamente relevante de 7.4 (que refleja las condiciones citosólicas intracelulares en el presinaptaso). Utilizando sistemas HDX-MS convencionales, comenzar a los 30 s no es apropiado ya que los datos HDX-MS corresponderían a la meseta de la reacción de intercambio, que no proporciona ninguna información conformacional útil. Sin embargo, el límite inferior de medición del instrumento HDX de milisegundos (correspondiente a un "tiempo muerto" de 50 ms) permite el monitoreo de la reacción de intercambio desde ~ 25% de finalización para el monómero aSyn a pH 7.4. Esto nos permitió capturar la mayor parte de la curva de captación cinética. Ajustar la curva de captación de deuterio a la ecuación 1 proporciona información cinética importante; corresponde a una estimación de la constante de tasa observada, kobs. Aunque no se trata aquí, es posible llevar a cabo experimentos de cinética de agregación y examinar las morfologías de las fibrillas de aSyn en las mismas condiciones de solución que los experimentos HDX-MS, ya que HDX-MS es altamente tolerante a una amplia gama de tampones8. Así, por ejemplo, los kobs del experimento HDX-MS se pueden correlacionar con los resultados de los experimentos de agregación para obtener información sobre qué conformaciones son más propensas a ciertos comportamientos de agregación y morfologías de fibrillas.
Para el caso simple de experimentos diferenciales HDX-MS, donde se deben comparar dos o más condiciones o variantes de proteínas, el área bajo la curva de absorción ajustada se puede integrar para cada estado y compararse entre sí. En este estudio, las áreas de captación para el Estado A y el Estado B se compararon en dos niveles diferentes de resolución estructural: resolución peptídica y resolución de aminoácidos, los cuales tienen fortalezas y desafíos distintos. Por ejemplo, los datos de resolución peptídica reflejan los datos espectrales en bruto más de cerca y han sido sometidos al menor procesamiento. Sin embargo, los datos de resolución de aminoácidos "aplanados" permiten que tanto la información peptídica como la de fragmentación suave se combinen en una sola salida en lugar de salidas separadas no fusionables y, en última instancia, presenten los datos a la resolución estructural más alta. Una limitación de la detección de espectrometría de masas del etiquetado HDX es el desafío de obtener resolución de aminoácidos. Si bien las técnicas de "fragmentación suave", como la disociación por transferencia de electrones (ETD), la disociación por captura de electrones (ECD) y la fotodisociación ultravioleta (UVPD), han demostrado ser efectivas para generar resoluciones más altas, siguen siendo desafiantes, impredecibles e ineficientes 30,43,44,45,46,47,48.
En comparación con otras técnicas estructurales, HDX-MS de milisegundos tiene la ventaja única de capturar la dinámica conformacional de aSyn monomérico a altas resoluciones estructurales y temporales. Como la cinética de intercambio rápido del monómero ya no es un factor limitante, se pueden realizar más estudios sobre aSyn monomérico con diferentes mutaciones, modificaciones post-traduccionales, componentes y concentraciones de sal, y socios de unión a pH fisiológico. La correlación de los resultados de HDX-MS con estudios funcionales, como la cinética de agregación y las morfologías de fibrillas, puede proporcionar información sobre los conformadores que promueven la función celular normal o son propensos a enfermedades. En última instancia, se anticipa que tal HDX-MS de milisegundos puede ser crucial para descubrir medicamentos dirigidos que estabilicen conformadores específicos tolerados fisiológicamente.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses contrapuestos.
Acknowledgments
NS está financiado por la Beca Del Jubileo de Diamante del Consejo Universitario. JJP cuenta con el apoyo de una beca UKRI Future Leaders Fellowship [Número de subvención: MR/T02223X/1].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column | Waters Corporation | 186002346 | Analytical column |
| Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv | VWR | 20060.420 | For LC mobile phases |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670 | Salt for HDX buffers |
| Chronos | Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) | 667006090 | Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell |
| Deuterium chloride | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-2-50 | For HDX labelling buffers |
| Deuterium oxide (99.9% D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-4 | Deuterated water |
| DynamX 3.0 | Waters Corporation | 176016027 | Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation |
| Enzymate BEH Pepsin Column | Waters Corporation | 186007233 | Pepsin digestion column |
| Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade | Fisher Scientific | 10596814 | For LC mobile phases |
| Guanidinium hydrochloride | Sigma Aldrich | RDD001-500G | Chaotrope/Denaturant |
| HDfleX | University of Exeter | N/A | https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982 |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | Salt for HDX buffers |
| LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot | Waters Corporation | 725000637 | Autosampler robot |
| Leucine enkephalin | Waters Corporation | 186006013 | For mass spectrometry lockspray calibration. |
| MassLynx | Waters Corporation | 667004007 | Software controlling inlet methods and mass spectrometer |
| Maximum recovery vials | Waters Corporation | 600000670CV | 100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2 |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Salt for HDX buffers |
| Millipore 0.22 µm syringe filters | Millipore | N9CA7069B | Syringe filters |
| ms2min | Applied Photophysics Ltd | N/A | fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | Salt for HDX buffers |
| Peltier temperature controller | LEAP Technologies Inc. | HP115-COOL/D | Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot. |
| ProteinLynx Global Server 3.0 | Waters Corporation | 715001030 | Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors. |
| Reagent pot caps | Waters Corporation | 186004632 | 100 pack |
| Reagent pots for LEAP HDX-2 | Waters Corporation | 186001420 | 100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2 |
| Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) | Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) | DLM-57 | For HDX labelling buffers |
| Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) | Amicon (Merck Sigma Aldrich) | UFC5003 | Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments. |
| Synapt G2-Si mass spectrometer | Waters Corporation | 176850035 | Mass spectrometer |
| Total recovery vials | Waters Corporation | 600000671CV | 100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2 |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253-250G | Buffer |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T60040-B2005 | Buffer |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378-1KG | Chaotrope/Denaturant |
| VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column | Waters Corporation | 186004623 | Trap desalting column |
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