Summary
Questo protocollo illustra un test di transcitosi delle cellule endoteliali in vitro come modello per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica interna misurando la capacità delle cellule endoteliali microvascolari retiniche umane di trasportare la perossidasi di rafano attraverso le cellule nei processi di trasporto transcellulare mediati da caveole.
Abstract
La disfunzione della barriera emato-retinica (BRB) contribuisce alla fisiopatologia di diverse malattie vascolari dell'occhio, spesso con conseguente edema retinico e conseguente perdita della vista. La barriera emato-retinica interna (iBRB) è composta principalmente da endotelio vascolare retinico con bassa permeabilità in condizioni fisiologiche. Questa caratteristica di bassa permeabilità è strettamente regolata e mantenuta da bassi tassi di trasporto paracellulare tra cellule endoteliali microvascolari retiniche adiacenti, nonché trasporto transcellulare (transcitosi) attraverso di esse. La valutazione della permeabilità della barriera transcellulare retinica può fornire informazioni fondamentali sull'integrità dell'iBRB in salute e malattia. In questo studio, descriviamo un test di transcitosi delle cellule endoteliali (EC), come modello in vitro per valutare la permeabilità all'iBRB, utilizzando cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC). Questo test valuta la capacità degli HRMEC di trasportare la transferrina e la perossidasi di rafano (HRP) nei processi di trasporto transcellulare mediati dal recettore e dalle caveole, rispettivamente. Gli HRMEC completamente confluenti coltivati su membrana porosa sono stati incubati con transferrina marcata con fluorescenza (transcitosi clatrin-dipendente) o HRP (transcitosi mediata da caveole) per misurare i livelli di transferrina o HRP trasferiti nella camera inferiore, indicativi dei livelli di transcitosi attraverso il monostrato EC. La segnalazione Wnt, una via nota che regola l'iBRB, è stata modulata per dimostrare il metodo di analisi della transcitosi basato su HRP mediato da caveolae. Il test di transcitosi EC qui descritto può fornire uno strumento utile per studiare i regolatori molecolari della permeabilità EC e dell'integrità di iBRB nelle patologie vascolari e per lo screening dei sistemi di somministrazione dei farmaci.
Introduction
La retina umana è uno dei tessuti più esigenti in termini di energia nel corpo. Il corretto funzionamento della retina neurale richiede un efficiente apporto di ossigeno e sostanze nutritive insieme a un flusso limitato di altre molecole potenzialmente dannose per proteggere l'ambiente retinico, che è mediato attraverso la barriera emato-retinica (BRB)1. Simile alla barriera emato-encefalica (BBB) nel sistema nervoso centrale, il BRB agisce come una barriera selettiva nell'occhio, regolando il movimento di ioni, acqua, aminoacidi e zucchero dentro e fuori dalla retina. BRB mantiene anche l'omeostasi retinica e il suo privilegio immunitario prevenendo l'esposizione a fattori circolatori come cellule immunitarie, anticorpi e agenti patogeni nocivi2. La disfunzione BRB contribuisce alla fisiopatologia di diverse malattie vascolari dell'occhio, come la retinopatia diabetica, la degenerazione maculare legata all'età (AMD), la retinopatia della prematurità (ROP), l'occlusione venosa retinica e l'uveite, con conseguente edema vasogenico e conseguente perdita della vista 3,4,5.
Il BRB è costituito da due barriere separate per due distinte reti vascolari oculari, rispettivamente: la vascolarizzazione retinica e il coriocapillare fenestrato sotto la retina. Il BRB interno (iBRB) è composto principalmente da cellule endoteliali microvascolari retiniche (RMEC) che rivestono la microvascolarizzazione retinica, che nutre gli strati neuronali retinici interni. D'altra parte, l'epitelio pigmentato retinico costituisce il componente principale del BRB esterno, che si trova tra la retina neurosensoriale e il coriocapillare2. Per l'iBRB, il trasporto molecolare attraverso le RMEC avviene attraverso entrambe le vie paracellulari e transcellulari (Figura 1). L'alto grado di selettività della sostanza attraverso l'iBRB si basa su (i) la presenza di complessi proteici giunzionali che limitano il trasporto paracellulare tra cellule endoteliali adiacenti (ECs) e (ii) bassi livelli di espressione di mediatori, trasportatori e recettori delle caveole all'interno delle cellule endoteliali che mantengono bassi tassi di trasporto transcellulare 1,6,7,8 . I complessi giunzionali che regolano il flusso paracellulare sono composti da giunzioni strette (claudine, occludine), giunzioni aderenti (caderine VE) e giunzioni gap (connessine), consentendo il passaggio di acqua e piccoli composti idrosolubili. Mentre le piccole molecole lipofile si diffondono passivamente attraverso l'interno delle RMEC, il movimento delle molecole lipofile e idrofile più grandi è regolato da vie transendoteliali guidate dall'ATP, tra cui il trasporto vescicolare e i trasportatori di membrana 5,9.
La transcitosi vescicolare può essere classificata come transcitosi caveolare mediata da caveolina, transcitosi clatrin-dipendente (e mediata dal recettore) e macropinocitosi indipendente dalla clatrina (Figura 2). Questi processi di trasporto vescicolare coinvolgono vescicole di dimensioni diverse, con i macropinosomi che sono i più grandi (che vanno da 200-500 nm) e le caveole che sono le più piccole (in media 50-100 nm), mentre le vescicole rivestite di clatrina vanno da 70-150 nm10. Le caveole sono invaginazioni della membrana plasmatica ricche di lipidi a forma di fiaschetta con un rivestimento proteico, composto principalmente da caveolina-1 che lega il colesterolo della membrana lipidica e altre proteine strutturali e di segnalazione attraverso il loro dominio di impalcatura caveolina11. Le caveoline lavorano insieme alla cavina attaccata perifericamente per promuovere la stabilizzazione delle caveole sulla membrana plasmatica12. Le membrane caveolari possono anche trasportare recettori per altre molecole come insulina, albumina e lipoproteine circolanti tra cui lipoproteine ad alta densità (HDL) e lipoproteine a bassa densità (LDL) per aiutare il loro movimento attraverso le cellule endoteliali13. Durante lo sviluppo, la formazione di BRB funzionale dipende dalla soppressione della transcitosi EC8. L'endotelio retinico maturo, quindi, ha livelli relativamente bassi di caveole, caveolina-1 e recettori dell'albumina rispetto ad altre cellule endoteliali in condizioni fisiologiche, contribuendo alle sue proprietà barriera 4,9.
Poiché la degradazione dell'iBRB è un importante segno distintivo di molte condizioni patologiche dell'occhio, è essenziale sviluppare metodi per valutare la permeabilità vascolare retinica in vivo e in vitro. Questi metodi aiutano a fornire probabili approfondimenti sui meccanismi di integrità della BRB compromessa e a valutare l'efficacia di potenziali bersagli terapeutici. Gli attuali saggi di imaging in vivo o di perdita vascolare quantitativa impiegano tipicamente fluorescenti (fluoresceina di sodio e destrano), colorimetrici (substrato di colorante blu di Evans e perossidasi di rafano [HRP]) o traccianti radioattivi14 per rilevare lo stravaso dalla vascolarizzazione nei tessuti retinici circostanti con imaging al microscopio o in lisato tissutale isolato. Un tracciante ideale per quantificare l'integrità vascolare dovrebbe essere inerte e abbastanza grande da permeare liberamente i vasi compromessi mentre è confinato all'interno di capillari sani e intatti. I metodi che impiegano fluoresceina di sodio o destrano coniugato con isotiocianato di fluoresceina (FITC-destrano) nell'angiografia con fluoresceina del fondo vivo (FFA) o in supporti piatti retinici isolati sono ampiamente utilizzati per quantificare lo stravaso retinico in vivo o ex vivo. Il fitc-destrano ha il vantaggio di essere disponibile in diversi pesi molecolari che vanno da 4-70 kDa per studi selettivi di dimensioni15,16,17. L'albumina FITC (~68 kDa) è un tracciante proteico alternativo di grandi dimensioni di rilevanza biologica per gli studi di perdita vascolare18. Il colorante Evans Blue, iniettato per via intracardica19, retroorbitalmente o attraverso la vena caudale 20, si basa anche sul suo legame con l'albumina endogena per formare una grande molecola che può essere quantificata principalmente mediante rilevazione spettrofotometrica o, meno comunemente, microscopia a fluorescenza in supporti piatti20,21. Queste metodologie quantitative o di imaging della luce, tuttavia, spesso non distinguono il trasporto paracellulare dal trasporto trans-endoteliale. Per l'analisi specifica della transcitosi con visualizzazione ultrastrutturale delle vescicole transcitose, molecole traccianti come HRP sono tipicamente utilizzate per localizzare vescicole transcitose all'interno di cellule endoteliali che possono essere osservate al microscopio elettronico22,23,24 (Figura 3A-C).
Lo sviluppo e l'uso di modelli iBRB in vitro per valutare la permeabilità delle cellule endoteliali potrebbe fornire una valutazione robusta e ad alto rendimento per integrare gli esperimenti in vivo e aiutare lo studio dei regolatori molecolari della perdita vascolare. I saggi comunemente usati per valutare il trasporto paracellulare e l'integrità delle giunzioni strette includono la resistenza elettrica transendoteliale (TEER), una misura della conduttanza ionica (Figura 4)2,25 e il saggio di perdita vascolare in vitro utilizzando traccianti fluorescenti a piccolo peso molecolare 26. Inoltre, i saggi di transcitosi basati sulla transferrina che modellano la BBB sono stati utilizzati per esplorare la transcitosi27 clatrina-dipendente. Nonostante ciò, i saggi per valutare la BRB e, più specificamente, la transcitosi caveolare EC retinica in vitro sono limitati.
In questo studio, descriviamo un test di transcitosi EC utilizzando cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC) come modello in vitro per determinare la permeabilità iBRB e la transcitosi EC. Questo test si basa sulla capacità degli HRMEC di trasportare la transferrina o la HRP attraverso le vie di transcitosi mediate dal recettore o caveolae-dipendenti, rispettivamente (Figura 2). Gli HRMEC coltivati fino alla piena confluenza nella camera apicale (cioè inserto filtrante) sono stati incubati con transferrina coniugata fluorescente (Cy3-Tf) o HRP per misurare l'intensità della fluorescenza corrispondente ai livelli di transferrina o HRP trasferiti alla camera inferiore esclusivamente attraverso la transcitosi EC. La confluenza del monostrato cellulare può essere confermata misurando TEER, indicando l'integrità della giunzione stretta25. Per dimostrare la tecnica di saggio TEER e transcitosi, sono stati utilizzati modulatori molecolari noti della permeabilità vascolare e della transcitosi EC, incluso il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF)28 e quelli nella segnalazione Wnt (ligandi Wnt: Wnt3a e Norrin)29.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il Boston Children's Hospital per la generazione di microscopia ottica e immagini EM (Figura 3). I protocolli per gli studi in vivo possono essere ottenuti da Wang et al.24. Tutti gli esperimenti che coinvolgono cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC) sono stati approvati dall'Institutional Biosafety Committee (IBC) del Boston Children's Hospital.
1. Preparazione dei reagenti
- Soluzione per il rivestimento di un piatto di coltura tissutale: preparare una soluzione di gelatina allo 0,1% sciogliendo 1 mL di soluzione madre di gelatina (40% -50%) in 500 ml di coltura tissutale sterile grado 1x PBS (pH = 7,4). Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm. Conservare la soluzione di gelatina allo 0,1% a 2-8°C. Può essere conservato alla suddetta temperatura per un tempo indefinito in condizioni sterili.
- Terreno di coltura: preparare 500 ml di terreno completo di crescita delle cellule endoteliali (EGM) sciogliendo gli integratori di EGM nel mezzo basale di crescita delle cellule endoteliali (EBM) secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali). Aliquote terreno di crescita in provette da 50 mL e conservare le provette a 4 °C. La durata di conservazione del terreno di coltura è di 12 mesi a 4 °C.
- Soluzione di tripsina: per la soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25%, aliquote dal flaconcino in provette da 50 mL e conservare a 4 °C (fino a 2 settimane) o -20 °C (fino a 24 mesi).
2. Coltura degli HRMEC
- Coltura cellulare iniziale
- Rivestire le piastre di Petri per colture cellulari (diametro 100 mm x altezza 20 mm) con 5 ml di soluzione di gelatina allo 0,1% sotto una cappa a flusso laminare e tenerle indisturbate nella cappa per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) per un rivestimento uniforme.
NOTA: Il rivestimento gelatinoso dei piatti migliora l'attaccamento cellulare. In alternativa, è possibile utilizzare anche palloni di coltura T75 rivestiti di gelatina. - Prima di seminare le cellule, aspirare la soluzione di gelatina usando una pompa per vuoto. La pressione del vuoto dell'aspiratore utilizzato era fino a 724 mmHg.
NOTA: L'aspirazione deve essere eseguita immediatamente prima della semina delle celle per evitare l'essiccazione della soluzione di rivestimento. - Scongelare un flaconcino congelato di HRMEC (da conservare in azoto liquido) usando un bagnomaria a 37 °C o aggiungendo un mezzo di crescita caldo nel flaconcino. Una volta scongelata, trasferire la sospensione cellulare a 9 ml di terreno di coltura (supponendo che il flaconcino scongelato degli HRMEC sia di 1 ml).
NOTA: Gli HRMEC sono stati ottenuti commercialmente (Tabella dei materiali). Il terreno di coltura aggiunto alle cellule deve essere sempre preriscaldato a 37 °C prima dell'uso. - Ruotare le cellule a 200 x g per 5 minuti a RT e aspirare attentamente il surnatante per evitare di rimuovere il pellet cellulare.
- Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di terreno di coltura e trasferire la sospensione risultante su una capsula di Petri rivestita di gelatina. Mantenere le celle nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2. In genere, gli HRMEC sono confluenti al 70% -80% dopo 72 ore.
NOTA: il mezzo di crescita viene cambiato a giorni alterni.
- Rivestire le piastre di Petri per colture cellulari (diametro 100 mm x altezza 20 mm) con 5 ml di soluzione di gelatina allo 0,1% sotto una cappa a flusso laminare e tenerle indisturbate nella cappa per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) per un rivestimento uniforme.
- Sottocoltura di HRMEC su inserti a membrana permeabile
- Preparare inserti filtranti per colture cellulari (inserti da 6,5 mm con membrana in policarbonato da 0,4 μm di dimensione dei pori, posti in una piastra a 24 pozzetti) per la semina degli HRMEC rivestendo ciascun inserto (camera apicale) con 200 μL di soluzione di gelatina allo 0,1% per 30 minuti sotto una cappa a flusso laminare. Assicurarsi che la soluzione copra l'intera superficie inferiore dell'inserto filtrante.
NOTA: Ogni pozzetto ha una camera apicale e basolaterale separata da una membrana porosa. - Estrarre la capsula di Petri con HRMEC coltivati (passo 2.1.5.) dall'incubatore e aspirare il terreno di coltura. Risciacquare delicatamente le cellule 2x con 10 ml di 1x PBS sotto una cappa a flusso laminare per eliminare potenziali cellule galleggianti / morte.
- Dissociare le cellule con 0,5-1 mL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% e posizionare la capsula di Petri nell'incubatore (37 °C e 5% CO2) per 5 minuti.
- Spegnere l'attività della tripsina aggiungendo 4,5-9 ml di terreno di coltura e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml utilizzando una pipetta da 10 ml.
- Ruotare le cellule a 200 x g per 5 minuti a RT, rimuovere con attenzione il surnatante e risospendere il pellet in 3 ml di terreno di crescita.
- Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro manuale o un contatore automatico di cellule e seme a una densità di 4 x 104 cellule per inserto del filtro (cioè 1,25 x 105 celle / cm2). Il volume della sospensione cellulare per ciascun inserto è di 250 μL.
- Aspirare la soluzione di rivestimento dai pozzetti contenenti inserti permeabili e trasferire 250 μL della sospensione cellulare per inserto (camera apicale). Aggiungere solo il mezzo (cioè senza celle) a uno degli inserti, che verrà utilizzato come "controllo vuoto" per la misurazione TEER. Contemporaneamente, aggiungere anche 750 μL di mezzo per pozzetto, nelle camere basolaterali.
- Conservare la piastra a 24 pozzetti con inserti permeabili nell'incubatore (37 °C e 5% di CO 2) per 7-12 giorni fino a quando le cellule in coltura diventano completamente confluenti e si raggiunge il valore TEER desiderato di ~20 Ω·cm2.
- Cambia il mezzo di crescita a giorni alterni. Durante il cambio del fluido, aspirare con attenzione il mezzo per ridurre al minimo la rottura del monostrato cellulare e aggiungere 250 μL e 750 μL di terreno fresco per pozzetto rispettivamente alle camere apicale e basolaterale.
NOTA: Il mezzo di crescita viene modificato sia per le camere apicali che basolaterali dei pozzetti.
- Preparare inserti filtranti per colture cellulari (inserti da 6,5 mm con membrana in policarbonato da 0,4 μm di dimensione dei pori, posti in una piastra a 24 pozzetti) per la semina degli HRMEC rivestendo ciascun inserto (camera apicale) con 200 μL di soluzione di gelatina allo 0,1% per 30 minuti sotto una cappa a flusso laminare. Assicurarsi che la soluzione copra l'intera superficie inferiore dell'inserto filtrante.
3. Misurazioni TEER (Figura 4)
- Il giorno 14 post semina delle celle (fase 2.2.9.), misurare il TEER per HRMEC utilizzando un sistema epiteliale volt-ohm meter (EVOM) di resistenza elettrica (ER) (Table of Materials) come segue.
- Precaricare il sistema ER e controllare la funzionalità del misuratore utilizzando l'elettrodo di prova STX04. Calibrare, se necessario.
- Collegare l'elettrodo al misuratore ed equilibrare l'elettrodo immergendolo prima in etanolo al 70% per 15-20 minuti e poi immergendolo brevemente nel terreno di coltura cellulare EGM.
- Nel frattempo, tenere la piastra a 24 pozzetti contenente celle nella cappa a flusso laminare a RT per 15-20 minuti per l'equilibrio della temperatura.
NOTA: le misurazioni TEER sono influenzate dalla temperatura, quindi la fase di equilibrio è essenziale. - Per la misurazione TEER, aggiungere terreno di coltura fresco sia alle camere apicali (250 μL) che basolaterali (750 μL) dei pozzetti.
- Eseguire la misurazione TEER immergendo attentamente l'elettrodo in modo che la punta più corta si trovi nell'inserto e la punta più lunga tocchi il fondo del pozzetto. Misurare prima la resistenza attraverso il controllo vuoto. Per ogni inserto, misurare TEER in triplice copia.
NOTA: Per il risciacquo dell'elettrodo tra le misurazioni, vengono utilizzati terreni di coltura. Assicurarsi che l'elettrodo sia tenuto con un angolo di 90° rispetto alla parte inferiore dell'inserto per letture stabili. - Calcolare la resistenza elettrica (in Ω·cm 2) attraverso il monostrato utilizzando la formula, TEER = resistenza netta (Ω) x superficie dell'inserto filtrante (cm2); Qui, la resistenza netta è la differenza tra la resistenza di ciascun pozzetto (mezzo di crescita con celle) e il pozzo bianco (solo mezzo di crescita).
- Effettuare un ulteriore trattamento delle cellule solo dopo che il valore TEER raggiunge ~20 Ω·cm2. Se il livello TEER desiderato non viene raggiunto, tenere la piastra nell'incubatore e misurare il TEER il giorno successivo.
NOTA: La confluenza HRMEC può anche essere validata mediante esame morfologico della forma cellulare (al microscopio) con morfologia tipica del ciottolo e/o dalla presenza di proteine di giunzione cellulare con colorazione immunoistochimica separata.
4. Saggio di transcitosi
- Saggio di transcitosi in vitro mediata da clatrina mediante transferrina marcata con Cy3 (Figura 5)
- Al raggiungimento della confluenza con valori di TEER intorno a 20 Ω·cm 2, il siero priva le cellule per 24 ore a 37 °C e il 5% di CO2 utilizzando lo 0,5% di FBS in EBM (mezzo ridotto dal siero) in entrambe le camere (camera apicale: 250 μL e camera basolaterale: 750 μL) prima del trattamento con il ligando. Durante il test è stata utilizzata EBM a siero ridotto.
- Incubare le cellule (utilizzando il mezzo ridotto dal siero nella fase 4.1.1.) nella camera apicale con ligando della transferrina (Cy3-Tf) marcato con fluorescenza (cianina 3) (concentrazione finale di 40 μg/ml) per 60 minuti a 37 °C.
NOTA: Le piastre contenenti Cy3-Tf devono essere protette dalla luce per evitare lo sbiancamento fotografico del Cy3-Tf avvolgendovi un foglio di alluminio ed eseguendo l'esperimento in una cappa di coltura cellulare con le luci spente. - Dopo 1 ora, posizionare la piastra sul ghiaccio e lavare il monostrato apicalmente e basolateralmente 4 volte (3-5 minuti per lavaggio) con il mezzo ridotto dal siero a RT per rimuovere il Cy3-Tf libero non legato.
NOTA: Il lavaggio è essenziale per rimuovere le molecole traccianti libere e consentire una lettura accurata della transcitosi senza potenziali perdite dalla via paracellulare. - Aggiungere il mezzo fresco ridotto dal siero (come al punto 4.1.1.) agli inserti filtranti accuratamente lavati contenenti cellule e trasferire gli inserti in pozzetti freschi della piastra a 24 pozzetti contenente il mezzo preriscaldato ridotto dal siero.
- Incubare le cellule per altri 90 minuti nell'incubatore (37 °C e 5% di CO2), quindi raccogliere il terreno dalla camera basolaterale.
- Registrare l'intensità di fluorescenza della soluzione dalla camera basolaterale utilizzando un rilevatore di fluorescenza. I livelli di intensità di fluorescenza, misurati come unità fluorescenti relative (RFU), indicano la quantità di complesso Cy3-Tf transcitoso attraverso il monostrato HRMEC tramite transcitosi clatrin-dipendente.
- Saggio di transcitosi in vitro mediato da caveole mediante HRP (Figura 6)
- Al raggiungimento della piena confluenza con valori di TEER intorno a 20 Ω·cm 2, il siero priva le cellule per 24 ore a 37 °C e al 5% di CO2 utilizzando terreno EBM contenente FBS allo 0,5% (terreno ridotto dal siero) prima del trattamento (come nella fase 4.1.1.). Il mezzo EBM ridotto dal siero è stato utilizzato durante l'intero test.
- Trattare le cellule nella camera apicale con i trattamenti desiderati e i controlli del veicolo.
NOTA: Qui, abbiamo usato i modulatori Wnt come esempio per dimostrare la regolazione della transcitosi mediata da caveole mediante la via di segnalazione Wnt negli HRMEC: Norrin ricombinante umano e inibitore Wnt XAV939. In un esperimento tipico, le cellule sono state trattate per 24 ore in un incubatore (37 °C e 5% CO2) con le seguenti concentrazioni: Norrin (125 ng/mL), Norrin (125 ng/mL) + XAV939 (10 μM) e soluzione di controllo del veicolo. Inoltre, è stato utilizzato anche un mezzo condizionato da Wnt3a (prodotto da cellule L Wnt-3A). - Incubare le cellule nella camera apicale con HRP (5 mg/ml) per 15 minuti a 37 °C.
- Successivamente, posizionare la piastra a 24 pozzetti sul ghiaccio e lavare intensamente le camere apicali e basolaterali 6 volte con tampone P (10 mM HEPES pH = 7,4, 1 mM piruvato di sodio, 10 mM glucosio, 3 mM CaCl2, 145 mM NaCl) per rimuovere l'HRP extracellulare libero.
NOTA: Il lavaggio è essenziale per rimuovere le molecole traccianti libere e consentire una lettura accurata della transcitosi senza potenziali perdite dalla via paracellulare. - Aggiungere il mezzo fresco ridotto dal siero (come al punto 4.1.1.) nella camera apicale e trasferire gli inserti in un pozzetto fresco contenente mezzi preriscaldati.
- Incubare il monostrato per altri 90 minuti nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2 prima di prelevare il mezzo dalla camera basolaterale.
- Al mezzo raccolto, aggiungere 100 μL di substrato fluorogenico della perossidasi HRP (tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore e incubare a RT per 10 minuti prima di interrompere la reazione con 100 μL di soluzione Stop.
- Rilevare i livelli di prodotto di reazione del substrato HRP nel fluido utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza. Misurare l'intensità di fluorescenza alla lunghezza d'onda di emissione di 420 nm (con eccitazione di 325 nm) e come unità fluorescenti relative (RFU). I valori indicano il livello di HRP transcitoso attraverso lo strato HRMEC attraverso la transcitosi mediata da caveole.
NOTA: Il prodotto fluorescente qui utilizzato (Tabella dei materiali) non fotocandeggia. Non è necessaria una protezione leggera contro il fotosbiancamento.
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Representative Results
Le immagini EM dell'endotelio vascolare retinico mostrano il trasporto vescicolare transcitotico e le vescicole caveolari nelle cellule endoteliali in vivo.
La transcitosi EC può essere visualizzata in vivo all'interno di sezioni trasversali retiniche con precipitato marrone scuro che riflette i vasi sanguigni contenenti HRP al microscopio ottico (Figura 3A) e come precipitato denso di elettroni indicativo di vescicole transcitotiche contenenti HRP (Figura 3B,C) utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione (TEM), dimostrando così la transcitosi EC attraverso l'iBRB. Le vescicole di grandi dimensioni riflettono potenzialmente la macropinocitosi (punta di freccia bianca; Figura 3B), e piccole vescicole rappresentano probabilmente vescicole caveolari (punte di freccia bianche; Figura 3C). Inoltre, la localizzazione delle caveole nei vasi sanguigni retinici può essere vista come co-colorazione dell'anticorpo CAV-1 del marcatore delle caveole con isolectina (marcatore EC) nel vaso sanguigno al microscopio a fluorescenza (Figura 3D). Le vescicole caveolari CAV-1 positive sono state identificate sotto TEM da anticorpi CAV-1 marcati con immunogold (punti neri; Figura 3E) all'interno delle cellule endoteliali vascolari retiniche. I protocolli per gli studi in vivo possono essere ottenuti da Wang et al.24.
Il trattamento con VEGF aumenta la permeabilità vascolare negli HRMEC misurata dalla resistenza elettrica transendoteliale (TEER)
Prima di eseguire i saggi di transcitosi EC, gli HRMEC devono essere coltivati fino alla piena confluenza, mostrando una caratteristica morfologia del ciottolo, che può essere osservata al microscopio ottico. La confluenza completa delle cellule può essere convalidata mediante misurazione della resistenza elettrica transendoteliale (TEER) (Figura 4A), con letture che raggiungono ~ 20 Ω ·cm2 per HRMEC confluenti30, suggerendo bassi livelli di trasporto paracellulare attraverso il monostrato attraverso giunzioni strette o vuote. Il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) è stato utilizzato come esempio per dimostrare la misurazione TEER. Il trattamento degli HRMEC con VEGF ha ridotto significativamente i livelli di TEER, riflettendo l'aumentata permeabilità HRMEC (Figura 4B). Una riduzione dei valori di TEER è stata osservata anche nelle cellule di controllo, potenzialmente a causa della durata della coltura e di misurazioni multiple effettuate a diversi intervalli di tempo che potrebbero essere dannosi per le cellule31.
Il trasporto della transferrina di Cy3 può essere utilizzato per valutare la transcitosi EC mediata da clatrina nelle HRMEC
Per la transcitosi EC mediata da clatrina, gli HRMEC confluenti coltivati su membrana porosa sono stati incubati con transferrina fluorescente (Cy3) per rilevare il suo trasporto attraverso EC (Figura 5A). Questo test sfrutta il fatto che il trasporto della transferrina è un processo di transcitosi mediato dal recettore. L'endocitosi della ci3-transferrina (rosso) è stata osservata nel monostrato HRMEC co-colorato con colorante nucleare, DAPI (blu) (Figura 5B), confermando il suo assorbimento nelle cellule. L'intensità di fluorescenza della transferrina marcata con (Cy3) può essere quantificata da immagini per valutare il processo di endocitosi e/o misurata dal mezzo raccolto dalla camera basolaterale dei pozzetti per quantificare i livelli di transcitosi mediata da clatrina27.
La via di segnalazione Wnt regola la transcitosi EC mediata da caveole attraverso le HRMEC in un test basato su HRP
In precedenza, è stato riscontrato che la segnalazione Wnt regola la transcitosi mediata da caveole MFSD2A attraverso le EC vascolari retiniche per mantenere iBRB24. Gli effetti dei modulatori Wnt sono stati valutati in un test di transcitosi in vitro basato su HRP (Figura 6A). Gli HRMEC completamente confluenti sono stati trattati con attivatori della via Wnt: terreno Wnt3a-condizionato (Wnt3a-CM) o Norrin ricombinante umano, con o senza inibitore del segnale Wnt/β-catenina XAV939, e sono stati rilevati i livelli di HRP transcitosa tra gli HRMEC. Il trattamento con Wnt3a-CM o Norrin ha rivelato una significativa diminuzione dei livelli di HRP transcitosa, indicativa di una ridotta transcitosi caveolare. Inoltre, il trattamento combinato con l'inibitore della segnalazione Wnt XAV939 ha dimostrato livelli sovraregolati di HRP transcitosa nelle HRMEC, cancellando così gli effetti degli attivatori di Wnt sulla permeabilità HRMEC (Figura 6B,C)24.
Figura 1: Diverse vie di trasporto attraverso l'endotelio vascolare retinico. Illustrazione schematica che mostra diverse vie di flusso molecolare attraverso le cellule endoteliali microvascolari retiniche (RMEC). Il trasporto attraverso le cellule endoteliali vascolari retiniche all'interno della barriera emato-retinica interna avviene attraverso due vie principali: vie paracellulari e transcellulari compresa la transcitosi. Questa cifra è stata adattata con il permesso di Yemanyi et al.5. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Panoramica delle vie di trasporto vescicolare transcitotico attraverso le cellule endoteliali e loro rispettiva valutazione in vitro . Nelle cellule endoteliali (ECs), la traslocazione transcellulare delle macromolecole avviene attraverso tre tipi principali di vescicole: vescicole caveolari (50-100 nm), vescicole rivestite di clatrina (70-150 nm) o macropinosomi indipendenti dalla clatrina (200-500 nm). Le caveole sono microdomini a forma di fiaschetta, sferici, ricchi di lipidi nella membrana plasmatica, composti da caveolina e cavine. I livelli di transcitosi attraverso queste vescicole possono essere determinati mediante saggi in vitro basati sulla fluorescenza in coltura EC utilizzando perossidasi di rafano (HRP) combinata con substrato fluorescente, transferrina marcata con fluorescenza (Cy3-Tf) o albumina sierica bovina marcata con tetrametilrodamamina (TMR-BSA) per transcitosi mediata da caveole, transcitosi mediata da clatrina e macropinocitosi, rispettivamente, per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica interna (iBRB). Mentre ogni via ha caratteristiche e meccanismi di trasporto distinti, possono verificarsi funzioni sovrapposte e trasporto di sostanze, in particolare tra trasporto caveolare e macropinocitosi, entrambi indipendenti dalla clatrina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Visualizzazione della transcitosi EC nella retina. (A) L'immagine del microscopio ottico mostra un lume dei vasi sanguigni riempito di HRP da una sezione retinica di topo wild type (WT) di 3 mesi, colorata con 3,3'-diamino benzidina (DAB) (nero). L'HRP è stata iniettata retroorbitalmente nei topi WT, seguita dall'isolamento oculare e dall'incorporazione dei tessuti. Le sezioni sottili sono state colorate con substrato DAB denso di elettroni per la rilevazione colorimetrica di HRP come precipitato marrone scuro e ripreso al microscopio ottico per rivelare HRP all'interno del lume dei vasi sanguigni della retina. (B,C) I campioni sono stati quindi ulteriormente elaborati con il sezionamento ultrasottile del microscopio elettronico a trasmissione (TEM) per visualizzare le vescicole transcitotiche contenenti HRP, raffiguranti la transcitosi EC attraverso l'iBRB. Le immagini TEM mostrano una sezione retinica di un topo WT di 3 mesi con lume dei vasi sanguigni riempito di HRP e vescicole contenenti HRP all'interno di RMEC. (B) Una grande vescicola occasionale riflette potenzialmente il macropinosoma (punta di freccia) all'interno delle EC con la presenza di globuli rossi (asterisco) sul lato luminale. (C) Le piccole vescicole sono probabilmente vescicole caveolari (punte di freccia). (D) La co-colorazione immunoistochimica dell'anticorpo CAV-1 (verde) e dell'isolectina B 4 (IB4, rosso, marcatore EC) dimostra la localizzazione di CAV-1 nei vasi sanguigni retinici nella retina del topo WT di 3 mesi (DAPI, blu). (E) immagine TEM del CAV-1 marcato con immunogold (punti neri, frecce) all'interno delle EC retiniche; nell'inserto mostra un'immagine ingrandita di una vescicola caveolare positiva CAV-1. Abbreviazioni: HRP = rafano perossidasi; GCL = strato di cellule ganglionari; IPL = strato plessiforme interno; INL = strato nucleare interno; OPL = strato plessiforme esterno; ONL = strato nucleare esterno; RPE = epitelio pigmentato retinico; E = cellula endoteliale; e L = lume dei vasi sanguigni. Ingrandimento: (A, D) 20x. Barre scala: (A) 50 μm, (B) 2 μm, (D) 100 μm e (C,E) 200 nm. Il pannello (E) è stato adattato con il permesso di Wang et al.24. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Validazione di HRMEC completamente confluenti e aumento della permeabilità vascolare negli HRMEC dopo il trattamento con VEGF . (A) Diagramma schematico che mostra il posizionamento degli elettrodi nelle camere apicali e basolaterali dei pozzetti per la misurazione della resistenza elettrica transendoteliale (TEER) come valutazione della permeabilità vascolare e dell'integrità del monostrato cellulare. (B) Grafico che mostra le registrazioni TEER di HRMEC completamente confluenti con e senza precedente trattamento con fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF). Il trattamento con VEGF dopo 18 ore (18 ore) determina una riduzione del TEER negli HRMEC completamente confluenti31. p≤0.001. Il pannello (B) è stato adattato con il permesso di Tomita et al.31. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Un'illustrazione schematica del test di transcitosi EC mediata da clatrina in HRMEC utilizzando transferrina (Tf). (A) Gli HRMEC sono stati coltivati fino alla piena confluenza su inserti rivestiti di gelatina e il siero è stato affamato per una notte a 37 °C prima del test. Le cellule sono state incubate apicamente con transferrina fluorescente coniugata Cy3 (Cy3-Tf) per 60 minuti a 37 °C. Dopo l'incubazione, le cellule sono state lavate intensamente con un terreno fresco per rimuovere Cy3-Tf extracellulare non legato. Gli inserti contenenti terreno fresco sono stati quindi trasferiti in una nuova piastra contenente mezzo caldo nella camera basolaterale e le cellule sono state incubate a 37 °C per ulteriori 90 minuti per rilasciare Cy3-Tf endocitoso. Il mezzo dalla camera basolaterale può essere raccolto e l'intensità di fluorescenza corrispondente alla transcitosi EC clatrin-dipendente (Cy3-Tf) può essere misurata utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza. (B) La ci3-transferrina (rossa) è stata osservata negli HRMEC colorati con DAPI (blu), confermando l'endocitosi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: La segnalazione Wnt regola la transcitosi HRMEC mediata da caveole in un test in vitro basato su HRP. (A) Illustrazione schematica che dimostra il saggio basato su HRP per valutare la transcitosi mediata da caveole. Gli HRMEC completamente confluenti coltivati su inserti rivestiti di gelatina sono stati affamati di siero per una notte in siero bovino fetale allo 0,5% (FBS) + mezzo EBM a 37 °C prima del trattamento. Il monostrato EC nella camera apicale è stato trattato con il trattamento desiderato per 24 ore a 37 °C. Successivamente, le cellule sono state incubate con perossidasi di rafano (HRP) a 37 ° C per 15 minuti e lavate intensamente per rimuovere la HRP extracellulare libera. Gli inserti contenenti terreno fresco sono stati quindi trasferiti in una nuova piastra contenente mezzo caldo in camere basolaterali e le cellule sono state incubate per altri 90 minuti a 37 °C. Il mezzo dalla camera basolaterale è stato raccolto e i livelli di HRP sono stati quantificati per reazione con substrato fluorogenico di perossidasi. La fluorescenza corrispondente alla transcitosi EC mediata da caveole è stata misurata utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza. (B,C) In questo esempio, le cellule sono state trattate con modulatori di pathway Wnt: mezzo condizionato da Wnt3a (Wnt3a-CM) o il suo mezzo condizionato dal controllo (Ctrl-CM), Norrin ricombinante umano o la sua soluzione di controllo (Ctrl) e con o senza inibitore di segnalazione Wnt/β-catenina (XAV939) o il suo controllo del veicolo (veicolo). I loro effetti sulla transcitosi caveolare HRMEC sono stati valutati nel test basato su HRP. Dopo il trattamento, sono stati misurati i livelli di HRP trasferiti nella camera basolaterale, indicando livelli di transcitosi EC mediata da caveole in tutti gli HRMEC. Gli attivatori Wnt hanno ridotto i livelli della transcitosi basata su HRP, che sono stati invertiti da XAV939. * p≤0.05, ** p≤0.01. I pannelli (B) e (C) sono stati adattati con il permesso di Wang et al.24. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
BRB svolge un ruolo essenziale nella salute e nella malattia della retina. Le tecniche in vitro che valutano la permeabilità vascolare si sono dimostrate strumenti cruciali negli studi riguardanti lo sviluppo e la funzione della barriera (BRB/BBB). La procedura qui descritta potrebbe essere utilizzata per studiare i meccanismi molecolari alla base della transcitosi EC o valutare i relativi modulatori molecolari che influenzano la permeabilità BRB. In vitro I saggi di transcitosi EC presentano molteplici vantaggi rispetto ai saggi in vivo o alle tecniche utilizzate per valutare la permeabilità vascolare. Sono veloci da eseguire con un elevato rendimento e possono essere utilizzati per analizzare gli effetti di molte variabili diverse o molecole isolate di specifiche vie di segnalazione con modulazione sia genetica che farmacologica. Il sistema di coltura CE puro cancella la variazione animale come spesso osservato in vivo e limita anche gli effetti di possibili modifiche o endocitosi delle molecole bersaglio da parte di altri tipi cellulari32. La gestione delle cellule HRMEC è semplice, richiede attrezzature di coltura cellulare di base disponibili nella maggior parte dei laboratori e la coltura cellulare è spesso più economica rispetto agli esperimenti sugli animali in vivo. Sebbene i saggi di transcitosi in vitro non riproducano completamente le condizioni fisiologiche in vivo33, possono essere strumenti preziosi per integrare gli studi in vivo e far progredire le nostre conoscenze sul controllo BRB.
Diversi importanti parametri tecnici richiedono considerazione, tra cui la dimensione dei pori dell'inserto del filtro, il tipo di substrato e la densità di semina delle celle. Una dimensione dei pori più ampia degli inserti filtranti permeabili potrebbe provocare una migrazione e una crescita indesiderate delle cellule sul lato inferiore dell'inserto, confondendo la misurazione risultante e la sua interpretazione. Mentre questa propensione può variare con i diversi tipi di cellule, i diametri dei pori ≤1 μm servono bene per la maggior parte dei tipi di cellule, comprese le EC34. La scelta di un substrato adatto è un secondo passo cruciale perché alcune cellule dimostrano una maggiore polarità e una maggiore differenziazione quando coltivate su substrato poroso e immerse in un terreno di coltura su entrambi i lati35,36. I filtri in policarbonato microporoso trattato sono un'alternativa migliore per le EC perché sono più sottili e forniscono un maggiore accesso dei reagenti alla zona basolaterale del monostrato con fluorescenza di fondo minima per i saggi immunologici35. Infine, al fine di ottenere un monostrato completamente confluente, la densità di semina delle celle deve essere ottimizzata in base al tipo di cella specifico. Mentre una densità di semina troppo bassa potrebbe influire sullo stato di differenziazione, una densità di semina troppo elevata, d'altra parte, potrebbe favorire il rapido attaccamento delle cellule formando più strati cellulari invece di un monostrato, alterando infine la morfologia cellulare e risultando in una misurazione imprecisa della transcitosi37.
La formazione e l'integrità del monostrato EC sono cruciali per questo test e possono essere convalidate misurando i valori TEER per garantire il raggiungimento del TEER desiderato. Un controllo in bianco, cioè un inserto filtrante senza celle, dovrebbe sempre essere incluso per misurare i livelli basali di resistenza attraverso la membrana permeabile da sottrarre da quelli degli inserti cellulari. Vari fattori come la temperatura, il numero di passaggi cellulari, la composizione del terreno di coltura, la durata della coltura e le variazioni della lunghezza giunzionale possono causare variazioni minori nei valori TEER 25,38,39. Anche i valori di TEER sono fortemente influenzati da alcuni trattamenti, come il VEGF. Scoperto inizialmente come potente induttore della permeabilità dei vasi40, il VEGF influenza la permeabilità vascolare regolando il trasporto paracellulare, cioè attraverso la fosforilazione delle proteine a giunzione stretta ZO-1, occludina e la rottura della proteina di giunzione stretta claudina-5 41,42 e il trasporto transcellulare 43 . Un'ulteriore convalida della formazione del monostrato può essere effettuata con l'esame morfologico e la presenza di proteine di giunzione caratteristiche con colorazione. Durante la coltura, si raccomanda di cambiare i mezzi in entrambe le camere apicali e basolaterali a intervalli regolari per mantenere le cellule nelle condizioni ottimali di coltura con l'intervallo di pH ideale e la disponibilità di nutrienti.
I ricercatori che utilizzano questo test dovrebbero prestare attenzione a una caratteristica intrinseca critica delle EC cerebrali e retiniche: la polarità apicobasale, che è un segno distintivo cellulare della BBB44 e, allo stesso modo, del BRB. La direzione della transcitosi è determinata dalla distribuzione relativa dei recettori bersaglio proteici di interesse e dal meccanismo di transcitosi associato nei domini apical/luminale vs. basolaterale/abluminale della membrana EC. Le EC cerebrali e retiniche sono in grado di rilasciare molti fattori sia dalle membrane apicali/luminali che basolaterali/abluminali44. È interessante notare che la transcitosi della transferrina clatrina-dipendente sembra verificarsi per lo più unidirezionalmente dal lato del sangue al cervello o alla retina, poiché i recettori della transferrina si trovano prevalentemente sulla membrana apicale/luminale45. La transcitosi caveolare, d'altra parte, avviene in modo bidirezionale e può originare dalla membrana apicale / luminale o basolaterale / abluminale e attraverso l'altro lato a seconda della localizzazione del carico vescicolare e dei loro recettori46. MFSD2A, un recettore lipidico transmembrana (per l'acido docosaesaenoico dell'acido grasso omega-3) e soppressore della transcitosi caveolare, è localizzato anche sui domini apicali/luminali di EC23,47. L'espressione di MFSD2A è regolata trascrizionalmente dalla segnalazione Wnt per mediare il suo impatto sul controllo BRB, come illustrato come esempio in questo protocollo24. La tecnica qui descritta, quindi, prevede la rilevazione di una molecola tracciante posta sulla camera superiore/apicale dopo l'assorbimento da parte del monostrato EC e il rilascio nella camera inferiore/basolaterale, imitando la transcitosi nella direzione apicale / luminale / sangue a basolaterale / abluminale / tessuto. Questo protocollo può essere modificato per rilevare la transcitosi nella direzione opposta posizionando molecole traccianti nella camera inferiore e monitorando l'assorbimento e il rilascio nella camera apicale per soddisfare le esigenze degli investigatori. Inoltre, se necessario, un ulteriore passo per determinare l'accumulo/degradazione intracellulare della molecola bersaglio legata al tracciante endocitoso produrrebbe ulteriori misurazioni delle vescicole transcitotiche rimanenti nel citosol32.
Il test descritto ha molti vantaggi e serve come strumento essenziale negli studi relativi a BRB / BBB, ma ci sono alcune limitazioni. Si tratta di un sistema isolato privo di interazioni da altri tipi cellulari dell'iBRB, come periciti e cellule gliali, e quindi non potrebbe imitare esattamente l'ambiente fisiologico in vivo. I valori TEER possono variare tra le misurazioni a causa di una variazione di temperatura o posizionamento degli elettrodi25,38. Tuttavia, l'equilibrio delle celle da 37 °C a temperatura ambiente prima delle misurazioni, un'attenta manipolazione degli elettrodi e l'inclusione di controlli vuoti possono aiutare a ridurre al minimo la fluttuazione. Inoltre, anche con un lavaggio sufficiente, la perdita dalla via paracellulare, sebbene in una quantità di tracce, non può essere completamente esclusa. Può anche verificarsi una sovrapposizione del trasporto HRP tra diverse vie di transcitosi, ad esempio tra trasporto caveolare e macropinocitosi, entrambi indipendenti dalla clatrina. Se necessario, la distinzione può essere ulteriormente studiata utilizzando specifici modulatori e/o inibitori delle caveole e della micropinocitosi.
In sintesi, questo articolo descrive un saggio di transcitosi in vitro che consente la quantificazione della transcitosi mediata da caveole o carrier attraverso il BRB / BBB. Il test in vitro potrebbe essere di grande aiuto nello screening di varie molecole pro-/ anti-angiogeniche31, modulatori di vie di segnalazione24 o sistemi di somministrazione di farmaci 27,48 relativi al controllo BRB / BBB. Anche lo studio della polarità EC e della transcitosi direzionale può trarre vantaggio da questo sistema facile da usare. Considerando la limitata disponibilità di modelli in vitro per iBRB e ricerca oculare, la procedura qui descritta potrebbe anche essere modificata come sistema di co-coltura insieme a periciti, astrociti e colture organotipiche 3D49, o utilizzando modelli cellulari avanzati come i sistemi neurovascolari microfisiologici50, al fine di studiare ulteriormente le interazioni cellulari e imitare meglio le condizioni fisiologiche in vivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse o interessi finanziari da divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH (R01 EY028100, EY024963 e EY031765) a JC. ZW è stato supportato da un Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 1286 | |
| Cell culture petridish | Nest Biotechnology | 704001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc. | 352097 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| Cyanine 3-human Transferrin | Jackson ImmunoResearch | AB_2337082 | |
| Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza Bioscience | CC-3156 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements | Lonza Bioscience | CC-4176 | |
| EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) | Millipore | MERS00002 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Lonza Bioscience | CC-4102B | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Hemocytometer (2-chip) | Bulldog Bio | DHC-N002 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8250 | |
| Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) | Cell Systems | ACBRI 181 | |
| Incubator | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 3110 | |
| L cells (for Control-conditioned medium) | ATCC | CRL-2648 | |
| L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 | |
| Light microscope | Leica | DMi1 | |
| Multimode Plate Reader | EnSight, PerkinElmer | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) | GIBCO | 10010-023 | |
| QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit | Thermo Fisher Scientific | 15169 | |
| Recombinant human Norrin (rhNorrin) | R&D Systems | 3014-NR | |
| Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) | R&D Systems | 293-VE | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Millipore | SLGP033RS | |
| Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) | Corning Inc. | CLS3470-48EA | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) | GIBCO | 25-200-072 | |
| Water bath | Precision, Thermo Fisher Scientific | 51221060 | |
| XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) | Selleckchem | S1180 |
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