Dit protocol illustreert een in vitro endotheelceltranscytosetest als een model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren door het vermogen van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen te meten om mierikswortelperoxidase over cellen te transporteren in caveolae-gemedieerde transcellulaire transportprocessen.
Disfunctie van de bloed-retinale barrière (BRB) draagt bij aan de pathofysiologie van verschillende vasculaire oogziekten, vaak resulterend in retinaal oedeem en daaropvolgend verlies van het gezichtsvermogen. De binnenste bloed-retinale barrière (iBRB) bestaat voornamelijk uit retinaal vasculair endotheel met lage permeabiliteit onder fysiologische omstandigheden. Dit kenmerk van lage permeabiliteit wordt strak gereguleerd en gehandhaafd door lage snelheden van paracellulair transport tussen aangrenzende retinale microvasculaire endotheelcellen, evenals transcellulair transport (transcytose) erdoorheen. De beoordeling van retinale transcellulaire barrièrepermeabiliteit kan fundamentele inzichten verschaffen in iBRB-integriteit in gezondheid en ziekte. In deze studie beschrijven we een endotheelcel (EC) transcytosetest, als een in vitro model voor het evalueren van iBRB-permeabiliteit, met behulp van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMECs). Deze test beoordeelt het vermogen van HRMECs om transferrine en mierikswortelperoxidase (HRP) te transporteren in respectievelijk receptor- en caveolae-gemedieerde transcellulaire transportprocessen. Volledig confluente HRMECs gekweekt op poreus membraan werden geïncubeerd met fluorescerend gelabeld transferrine (clathrin-afhankelijke transcytose) of HRP (caveolae-gemedieerde transcytose) om de niveaus van transferrine of HRP te meten die naar de onderste kamer werden overgebracht, wat wijst op transcytoseniveaus in de EC-monolaag. Wnt-signalering, een bekende route die iBRB reguleert, werd gemoduleerd om de caveolae-gemedieerde HRP-gebaseerde transcytose-testmethode te demonstreren. De hier beschreven EC-transcytosetest kan een nuttig hulpmiddel zijn voor het onderzoeken van de moleculaire regulatoren van EC-permeabiliteit en iBRB-integriteit in vasculaire pathologieën en voor het screenen van medicijnafgiftesystemen.
Het menselijk netvlies is een van de meest energie-eisende weefsels in het lichaam. Een goede werking van het neurale netvlies vereist een efficiënte toevoer van zuurstof en voedingsstoffen, samen met een beperkte flux van andere potentieel schadelijke moleculen om de retinale omgeving te beschermen, die wordt gemedieerd via de bloed-retinale barrière (BRB)1. Vergelijkbaar met de bloed-hersenbarrière (BBB) in het centrale zenuwstelsel, fungeert de BRB als een selectieve barrière in het oog en reguleert de beweging van ionen, water, aminozuren en suiker in en uit het netvlies. BRB handhaaft ook retinale homeostase en zijn immuunprivilege door blootstelling aan circulatoire factoren zoals immuuncellen, antilichamen en schadelijke pathogenen te voorkomen2. BRB-disfunctie draagt bij aan de pathofysiologie van verschillende vasculaire oogziekten, zoals diabetische retinopathie, leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), retinopathie van prematuriteit (ROP), retinale ader occlusie en uveïtis, resulterend in vasogeen oedeem en daaropvolgend verlies van het gezichtsvermogen 3,4,5.
De BRB bestaat uit twee afzonderlijke barrières voor twee verschillende oculaire vasculaire netwerken, respectievelijk: de retinale vasculatuur en de fenestrated choriocapillaris onder het netvlies. De binnenste BRB (iBRB) bestaat voornamelijk uit retinale microvasculaire endotheelcellen (RMEC’s) die de retinale microvasculatuur bekleden, die de binnenste retinale neuronale lagen voedt. Aan de andere kant vormt het retinale pigmentepitheel het belangrijkste onderdeel van de buitenste BRB, die tussen het neurosensorische netvlies en choriocapillaris2 ligt. Voor de iBRB vindt moleculair transport over RMEC’s plaats via zowel paracellulaire als transcellulaire routes (figuur 1). De hoge mate van stofselectiviteit in de iBRB is afhankelijk van (i) de aanwezigheid van junctionele eiwitcomplexen die het paracellulaire transport tussen aangrenzende endotheelcellen (EC’s) beperken, en (ii) lage expressieniveaus van caveolae-mediatoren, transporters en receptoren in de endotheelcellen die lage transcellulaire transportsnelheden handhaven 1,6,7,8 . Junctionele complexen die de paracellulaire flux reguleren, bestaan uit tight junctions (claudins, occludins), adherens junctions (VE cadherins) en gap junctions (connexinen), waardoor de doorgang van water en kleine in water oplosbare verbindingen mogelijk is. Terwijl kleine lipofiele moleculen passief diffunderen over het binnenste van RMEC’s, wordt de beweging van grotere lipofiele en hydrofiele moleculen gereguleerd door ATP-aangedreven trans-endotheelroutes, waaronder vesiculaire transport- en membraantransporters 5,9.
Vesiculaire transcytose kan worden gecategoriseerd als caveolin-gemedieerde caveolaire transcytose, clathrine-afhankelijke (en receptor-gemedieerde) transcytose en clathrin-onafhankelijke macropinocytose (figuur 2). Deze vesiculaire transportprocessen omvatten blaasjes van verschillende grootte, waarbij macropinosomen de grootste zijn (variërend van 200-500 nm) en caveolae de kleinste (gemiddeld 50-100 nm), terwijl clathrin-gecoate blaasjes variëren van 70-150 nm10. Caveolae zijn kolfvormige lipiderijke plasmamembraaninvaginaties met een eiwitlaag, voornamelijk samengesteld uit caveolin-1 die lipidemembraancholesterol en andere structurele en signaaleiwitten bindt via hun caveolin-steigerdomein11. Caveolins werken samen met perifeer gehechte cavin om caveolae-stabilisatie op het plasmamembraan te bevorderen12. Caveolar membranen kunnen ook receptoren dragen voor andere moleculen zoals insuline, albumine en circulerende lipoproteïnen, waaronder high-density lipoprotein (HDL) en low-density lipoprotein (LDL) om hun beweging over endotheelcellen te ondersteunen13. Tijdens de ontwikkeling hangt de vorming van functionele BRB af van de onderdrukking van EC-transcytose8. Volwassen retinaal endotheel heeft daarom relatief lage niveaus van caveolae-, caveolin-1- en albuminereceptoren ten opzichte van andere endotheelcellen onder fysiologische omstandigheden, wat bijdraagt aan de barrière-eigenschappen 4,9.
Omdat iBRB-afbraak een belangrijk kenmerk is van veel pathologische oogaandoeningen, is het essentieel om methoden te ontwikkelen om de retinale vasculaire permeabiliteit in vivo en in vitro te beoordelen. Deze methoden helpen waarschijnlijk inzicht te geven in de mechanismen van gecompromitteerde BRB-integriteit en beoordelen de werkzaamheid van potentiële therapeutische doelen. Huidige in vivo beeldvorming of kwantitatieve vasculaire lekkagetests maken meestal gebruik van fluorescerende (natriumfluoresceïne en dextran), colorimetrisch (Evans Blue-kleurstof en mierikswortelperoxidase [HRP] substraat) of radioactieve tracers14 om extravasatie van de vasculatuur naar omliggende retinale weefsels te detecteren met microscoopbeeldvorming of in geïsoleerd weefsellysaat. Een ideale tracer voor het kwantificeren van vasculaire integriteit moet inert en groot genoeg zijn om gecompromitteerde bloedvaten vrij te doordringen terwijl ze beperkt zijn tot gezonde en intacte haarvaten. Methoden die natriumfluoresceïne of fluoresceïne isothiocyanaat-geconjugeerde dextran (FITC-dextran) gebruiken in levende fundus fluoresceïneangiografie (FFA) of geïsoleerde retinale flat mounts worden veel gebruikt voor het kwantificeren van retinale extravasatie in vivo of ex vivo. FITC-dextran heeft het voordeel dat het beschikbaar is in verschillende molecuulgewichten, variërend van 4-70 kDa voor grootteselectieve studies 15,16,17. FITC-albumine (~68 kDa) is een alternatieve grootschalige eiwittracer van biologische relevantie voor vasculaire lekkagestudies18. Evans Blue-kleurstof, geïnjecteerd intracardiaal19, retro-orbitaal of door de staartader20, vertrouwt ook op zijn binding met endogene albumine om een groot molecuul te vormen dat kan worden gekwantificeerd door meestal spectrofotometrische detectie of, minder vaak, fluorescentiemicroscopie in platte mounts20,21. Deze kwantitatieve of lichte beeldvormingsmethoden maken echter vaak geen onderscheid tussen paracellulair transport en trans-endotheeltransport. Voor de specifieke analyse van transcytose met ultrastructurele visualisatie van getranscytoseerde blaasjes, worden tracermoleculen zoals HRP meestal gebruikt om transcytosed blaasjes te lokaliseren in endotheelcellen die kunnen worden waargenomen onder een elektronenmicroscoop 22,23,24 (figuur 3A-C).
De ontwikkeling en het gebruik van in vitro iBRB-modellen om de permeabiliteit van endotheelcellen te evalueren, zou een robuuste en hoge doorvoerbeoordeling kunnen bieden als aanvulling op in vivo experimenten en het onderzoek naar moleculaire regulatoren van vasculaire lekkage te ondersteunen. Veelgebruikte testen om het paracellulaire transport en de integriteit van tight junctions te beoordelen, zijn trans-endotheel elektrische weerstand (TEER), een maat voor ionische geleiding (figuur 4) 2,25, en in vitro vasculaire lekkagetest met behulp van fluorescerende tracers met een klein molecuulgewicht26. Bovendien zijn transferrine-gebaseerde transcytose-assays die BBB modelleren gebruikt om clathrin-afhankelijke transcytose27 te onderzoeken. Desondanks zijn de testen om BRB en, meer specifiek, retinale EC caveolaire transcytose in vitro te evalueren beperkt.
In deze studie beschrijven we een EC-transcytosetest met behulp van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMECs) als een in vitro model om iBRB-permeabiliteit en EC-transcytose te bepalen. Deze test is gebaseerd op het vermogen van HRMECs om transferrine of HRP te transporteren via respectievelijk de receptor-gemedieerde of caveolae-afhankelijke transcytoseroutes (figuur 2). HRMECs gekweekt tot volledige confluentie in de apicale kamer (d.w.z. filterinzet) werden geïncubeerd met fluorescerend-geconjugeerd transferrine (Cy3-Tf) of HRP om de fluorescentie-intensiteit te meten die overeenkomt met de niveaus van transferrine of HRP die uitsluitend door EC-transcytose naar de onderste kamer worden overgebracht. De samenvloeiing van de celmonolaag kan worden bevestigd door TEER te meten, wat de tight junction-integriteitaangeeft 25. Om de TEER- en transcytosetesttechniek aan te tonen, werden bekende moleculaire modulatoren van vasculaire permeabiliteit en EC-transcytose gebruikt, waaronder vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF)28 en die in Wnt-signalering (Wnt-liganden: Wnt3a en Norrin)29.
BRB speelt een essentiële rol in de gezondheid en ziekte van het netvlies. In vitro technieken die de vasculaire permeabiliteit beoordelen, zijn cruciale hulpmiddelen gebleken in studies met betrekking tot de ontwikkeling en functie van barrières (BRB/BBB). De hier beschreven procedure kan worden gebruikt om de moleculaire mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan EC-transcytose of om gerelateerde moleculaire modulatoren te evalueren die de BRB-permeabiliteit beïnvloeden. In vitro EC-tra…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies (R01 EY028100, EY024963 en EY031765) aan JC. ZW werd ondersteund door een Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.
Biological Safety Cabinet | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 1286 | |
Cell culture petridish | Nest Biotechnology | 704001 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
Centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc. | 352097 | |
Centrifuge tubes (50 mL) | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
Cyanine 3-human Transferrin | Jackson ImmunoResearch | AB_2337082 | |
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza Bioscience | CC-3156 | |
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements | Lonza Bioscience | CC-4176 | |
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) | Millipore | MERS00002 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Lonza Bioscience | CC-4102B | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Hemocytometer (2-chip) | Bulldog Bio | DHC-N002 | |
Horseradish Peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8250 | |
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) | Cell Systems | ACBRI 181 | |
Incubator | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 3110 | |
L cells (for Control-conditioned medium) | ATCC | CRL-2648 | |
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 | |
Light microscope | Leica | DMi1 | |
Multimode Plate Reader | EnSight, PerkinElmer | ||
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) | GIBCO | 10010-023 | |
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit | Thermo Fisher Scientific | 15169 | |
Recombinant human Norrin (rhNorrin) | R&D Systems | 3014-NR | |
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) | R&D Systems | 293-VE | |
Syringe filter (0.22 µm) | Millipore | SLGP033RS | |
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) | Corning Inc. | CLS3470-48EA | |
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) | GIBCO | 25-200-072 | |
Water bath | Precision, Thermo Fisher Scientific | 51221060 | |
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) | Selleckchem | S1180 |