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Medicine

내피 세포 트랜스사이토시스 분석법(Endothelial Cell Transcytosis assay)은 내부 혈액-망막 장벽 투과성을 평가하기 위한 시험관 내 모델로서 분석합니다.

Published: June 07, 2022
doi:
10.3791/64076
, , , , , ,
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital,Harvard Medical School

Summary

이 프로토콜은 카베올라 매개 세포 횡단 수송 과정에서 세포를 가로질러 양 고추냉이 과산화 효소를 운반하는 인간 망막 미세 혈관 내피 세포의 능력을 측정하여 내부 혈액 망막 장벽 투과성을 평가하는 모델로서 시험관 내 내피 세포 트랜스사이토시스 분석을 보여줍니다.

Abstract

혈액 망막 장벽 (BRB)의 기능 장애는 여러 혈관 안 질환의 병태 생리학에 기여하여 종종 망막 부종 및 후속 시력 상실을 초래합니다. 내부 혈액-망막 장벽(iBRB)은 주로 생리적 조건에서 투과성이 낮은 망막 혈관 내피로 구성됩니다. 낮은 투과성의이 특징은 인접한 망막 미세 혈관 내피 세포 사이의 낮은 세포 간 수송 속도뿐만 아니라이를 통한 세포 간 수송 (transcytosis)에 의해 엄격하게 조절되고 유지됩니다. 망막 세포 횡단 장벽 투과성의 평가는 건강 및 질병에서 iBRB 무결성에 대한 근본적인 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 연구에서는 인간 망막 미세 혈관 내피 세포 (HRMECs)를 사용하여 iBRB 투과성을 평가하기위한 시험관 내 모델로서 내피 세포 (EC) transcytosis 분석을 설명합니다. 이 분석은 수용체 및 카베올라 매개 세포 간 수송 과정에서 각각 트랜스페린 및 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)를 수송하는 HRMEC의 능력을 평가합니다. 다공성 막에서 배양 된 완전히 합류 된 HRMEC를 형광 태그 트랜스페린 (클라 트린 의존성 트랜스 사이토 시스) 또는 HRP (카베 올라 매개 트랜스 사이토 시스)와 함께 배양하여 EC 단층 전체의 트랜스사이토 시스 수준을 나타내는 바닥 챔버로 전달 된 트랜스페린 또는 HRP의 수준을 측정했습니다. iBRB를 조절하는 알려진 경로인 Wnt 신호전달은 카베올라 매개 HRP 기반 트랜스사이토시스 분석 방법을 입증하기 위해 조절되었습니다. 여기에 설명된 EC 트랜스사이토시스 분석은 혈관 병리학에서 EC 투과성 및 iBRB 무결성의 분자 조절자를 조사하고 약물 전달 시스템을 스크리닝하는 데 유용한 도구를 제공할 수 있습니다.

Introduction

인간의 망막은 신체에서 가장 높은 에너지를 요구하는 조직 중 하나입니다. 신경 망막의 적절한 기능을 위해서는 망막 환경을 보호하기 위해 잠재적으로 유해한 다른 분자의 제한된 흐름과 함께 산소와 영양소의 효율적인 공급이 필요하며, 이는 망막 장벽(BRB)1을 통해 매개됩니다. 중추 신경계의 혈액-뇌 장벽(BBB)과 유사하게 BRB는 눈의 선택적 장벽 역할을 하여 망막 안팎으로 이온, 물, 아미노산 및 당의 이동을 조절합니다. BRB는 또한 면역 세포, 항체 및 유해한 병원체와 같은 순환 인자에 대한 노출을 방지함으로써 망막 항상성과 면역 특권을 유지합니다2. BRB 기능 장애는 당뇨병성 망막증, 연령 관련 황반변성(AMD), 미숙아 망막병증(ROP), 망막 정맥 폐색 및 포도막염과 같은 여러 혈관 안 질환의 병태생리학에 기여하여 혈관성 부종 및 후속 시력 상실을 초래합니다 3,4,5.

BRB는 각각 두 개의 별개의 안구 혈관 네트워크에 대한 두 개의 개별 장벽으로 구성됩니다 : 망막 혈관 구조와 망막 아래의 창공 된 융모 모세 혈관. 내부 BRB(iBRB)는 주로 망막 미세혈관을 감싸는 망막 미세혈관 내피 세포(RMEC)로 구성되어 있으며, 이는 내부 망막 신경층에 영양을 공급합니다. 한편, 망막 색소 상피는 신경 감각 망막과 융모막 모세 혈관 2 사이에있는 외부 BRB의 주요 구성 요소를형성합니다. iBRB의 경우 RMEC를 통한 분자 수송은 세포 간 경로와 세포 간 경로를 통해 발생합니다(그림 1). iBRB에 걸친 높은 수준의 물질 선택성은 (i) 인접한 내피 세포(EC) 사이의 세포내 수송을 제한하는 접합 단백질 복합체의 존재 및 (ii) 낮은 세포 간 수송 속도를 유지하는 내피 세포 내의 카베올라 매개체, 수송체 및 수용체의 낮은 발현 수준에 의존합니다.1,6,7,8 . paracellular 플럭스를 조절하는 접합 복합체는 단단한 접합 (클로딘, 오클루 딘), 부착 접합 (VE cadherins) 및 갭 접합 (connexins)으로 구성되어있어 물과 작은 수용성 화합물의 통과를 허용합니다. 작은 친유성 분자가 RMEC의 내부를 가로질러 수동적으로 확산되는 반면, 더 큰 친유성 및 친수성 분자의 이동은 소포 수송 및 막 수송체(5,9)를 포함하는 ATP 구동 내피 횡단 경로에 의해 조절됩니다.

수포 트랜스사이토시스는 카베올린 매개 카베올라 트랜스사이토시스, 클라트린 의존성(및 수용체 매개) 트랜스사이토시스 및 클라트린 비의존성 마크로피노사이토시스로 분류할 수 있습니다(그림 2). 이러한 소포 수송 과정은 다양한 크기의 소포를 포함하며, 마크로 피노솜이 가장 크고 (200-500 nm 범위) 카베 올라는 가장 작으며 (평균 50-100 nm), 클라 트린 코팅 소포는 70-150 nm 범위입니다10. Caveolae는 단백질 코트가있는 플라스크 모양의 지질이 풍부한 원형질막 침범으로, 주로 카베 올린 -1로 구성되어 지질막 콜레스테롤 및 기타 구조 및 신호 전달 단백질을 카베 올린-11 도메인을 통해 결합합니다. 카베올린은 원형질막(12)에서 카베올라 안정화를 촉진하기 위해 말초로 부착된 카빈과 함께 작용한다. Caveolar 막은 또한 인슐린, 알부민, 및 고밀도 지단백질 (HDL) 및 저밀도 지단백질 (LDL)을 포함하는 순환 지단백질과 같은 다른 분자에 대한 수용체를 운반하여 내피 세포13을 통한 이동을 지원할 수 있습니다. 발달 중에, 기능성 BRB의 형성은 EC transcytosis8의 억제에 달려있다. 따라서 성숙한 망막 내피는 생리적 조건 하에서 다른 내피 세포에 비해 상대적으로 낮은 수준의 카베올라, 카베올린-1 및 알부민 수용체를 가지며장벽 특성에 기여합니다4,9.

iBRB 파괴는 많은 병리학적 눈 상태의 주요 특징이기 때문에 생체 내 및 체외에서 망막 혈관 투과성을 평가하는 방법을 개발하는 것이 필수적입니다. 이러한 방법은 손상된 BRB 무결성의 메커니즘에 대한 가능한 통찰력을 제공하고 잠재적 치료 표적의 효능을 평가하는 데 도움이 됩니다. 현재의 생체내 이미징 또는 정량적 혈관 누출 분석은 전형적으로 형광(나트륨 플루오레세인 및 덱스트란), 비색(에반스 블루 염료 및 호스래디쉬 퍼옥시다제[HRP] 기질) 또는 방사성 추적자(14)를 사용하여 현미경 이미징 또는 분리된 조직 용해물에서 혈관구조로부터 주변 망막 조직으로의 혈관 외유출을 검출한다. 혈관 무결성을 정량화하기 위한 이상적인 추적자는 불활성이어야 하며 건강하고 온전한 모세혈관 내에 갇혀 있는 동안 손상된 혈관을 자유롭게 투과할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. 살아있는 안저 플루오레세인 혈관 조영술(FFA) 또는 분리된 망막 플랫 마운트에서 나트륨 플루오레세인 또는 플루오레세인 이소티오시아네이트 컨쥬게이트 덱스트란(FITC-덱스트란)을 사용하는 방법은 생체 내 또는 생체 외 망막 혈관 외 유출을 정량하는 데 널리 사용됩니다. FITC-덱스트란은 크기 선택적 연구15,16,17을 위해 4-70kDa 범위의 다양한 분자량으로 이용 가능하다는 장점이 있습니다. FITC- 알부민 (~ 68 kDa)은 혈관 누출 연구18에 대한 생물학적 관련성의 대체 대형 단백질 추적자입니다. 심장 내 (19), 역궤도 또는 꼬리 정맥 (20)을 통해 주입 된 에반스 블루 염료는 또한 내인성 알부민과의 결합에 의존하여 대부분 분광 광도계 검출 또는 덜 일반적으로 플랫 마운트(20,21)에서 형광 현미경에 의해 정량화 될 수있는 큰 분자를 형성한다. 그러나 이러한 정량적 또는 광 이미징 방법론은 종종 세포 내 내 수송과 내피 간 수송을 구별하지 못합니다. 트랜스사이토시스 소포의 초구조적 시각화를 통한 트랜스사이토시스의 특이적 분석을 위해, HRP와 같은 추적 분자는 전형적으로 전자 현미경22,23,24 하에서 관찰될 수 있는 내피 세포 내의 트랜스사이토시스 소포를 찾는 데 사용된다(도 3A-C).

내피 세포 투과성을 평가하기 위한 시험관 내 iBRB 모델의 개발 및 사용은 생체 내 실험을 보완하고 혈관 누출의 분자 조절자 조사를 지원하기 위해 강력하고 높은 처리량 평가를 제공할 수 있습니다. 초세포 수송 및 단단한 접합의 무결성을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 분석에는 경내피 전기 저항(TEER), 이온 전도도 측정(그림 4)2,25 및 소분자량 형광 추적자(26)를 사용한 시험관 내 혈관 누출 분석이 포함됩니다. 또한, BBB를 모델링하는 트랜스페린 기반 트랜스사이토시스 분석은 클라트린-의존성 트랜스사이토시스27을 탐구하기 위해 활용되었다. 그럼에도 불구하고, BRB 및 보다 구체적으로, 시험관 내에서 망막 EC 카베올라 트랜스사이토시스를 평가하기 위한 분석은 제한적이다.

이 연구에서는 iBRB 투과성 및 EC 트랜스사이토시스를 결정하기 위한 시험관 내 모델로 인간 망막 미세혈관 내피 세포(HRMEC)를 사용하는 EC 트랜스사이토시스 분석을 설명합니다. 이 분석은 각각 수용체 매개 또는 카베올라 의존성 트랜스사이토시스 경로를 통해 트랜스페린 또는 HRP를 수송하는 HRMEC의 능력에 의존합니다(그림 2). 정점 챔버 (즉, 필터 삽입)에서 완전히 응축 된 HRMEC를 형광 공액 트랜스페린 (Cy3-Tf) 또는 HRP와 함께 배양하여 EC 트랜스사이토 시스를 통해 바닥 챔버로 전달 된 트랜스페린 또는 HRP의 수준에 해당하는 형광 강도를 측정했습니다. 세포 단층의 컨플루언스는 TEER을 측정함으로써 확인할 수 있으며, 이는 타이트한 접합 완전성을 나타낸다(25). TEER 및 트랜스사이토시스 분석 기술을 입증하기 위해, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)28 및 Wnt 신호전달(Wnt 리간드: Wnt3a 및 Norrin)29을 포함하여 혈관 투과성 및 EC 트랜스사이토시스의 공지된 분자 조절제가 사용되었습니다.

Protocol

모든 동물 실험은 광학 현미경 및 EM 이미지 생성을 위해 보스턴 아동 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다(그림 3). 생체내 연구를 위한 프로토콜은 Wang et al.24로부터 얻을 수 있다. 인간 망막 미세 혈관 내피 세포 (HRMECs)와 관련된 모든 실험은 보스턴 아동 병원의 기관 생물 안전위원회 (IBC)의 승인을 받았습니다. <p class=…

Representative Results

망막 혈관 내피의 EM 이미지는 생체 내 내피 세포에서 경세포 소포 수송 및 동굴 소포를 보여줍니다.EC 트랜스사이토시스는 광학 현미경(그림 3A)에서 HRP 함유 혈관을 반사하는 짙은 갈색 침전물이 있는 망막 단면 내에서 생체 내에서 시각화할 수 있으며, 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 HRP 함유 트랜스사이토시클(그림 3B,C</stro…

Discussion

BRB는 망막 건강과 질병에 필수적인 역할을 합니다. 혈관 투과성을 평가하는 시험관 내 기술은 장벽 (BRB / BBB) 발달 및 기능에 관한 연구에서 중요한 도구로 입증되었습니다. 여기에 설명 된 절차는 EC transcytosis의 기초가되는 분자 메커니즘을 연구하거나 BRB 투과성에 영향을 미치는 관련 분자 조절제를 평가하는 데 활용 될 수 있습니다. 시험관 내 EC 트랜스사이토시스 분석은 생체 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 JC에 대한 NIH 보조금(R01 EY028100, EY024963 및 EY031765)의 지원을 받았습니다. ZW는 Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant의 지원을 받았습니다.

Materials

Biological Safety Cabinet  Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 1286
Cell culture petridish  Nest Biotechnology 704001
Centrifuge  Eppendorf 5702
Centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc. 352097
Centrifuge tubes (50 mL) Denville Scientific Inc. C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin  Jackson ImmunoResearch AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza Bioscience CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements Lonza Bioscience CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) Millipore MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS) Lonza Bioscience CC-4102B
Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Hemocytometer (2-chip) Bulldog Bio DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) Cell Systems ACBRI 181
Incubator Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 3110
L cells (for Control-conditioned medium) ATCC CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) ATCC CRL-2647
Light microscope Leica DMi1
Multimode Plate Reader EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) GIBCO 10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit Thermo Fisher Scientific 15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin) R&D Systems 3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) R&D Systems 293-VE
Syringe filter (0.22 µm) Millipore SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) Corning Inc. CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) GIBCO 25-200-072
Water bath Precision, Thermo Fisher Scientific 51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) Selleckchem S1180
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References

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Keywords: Endothelial Cell Transcytosis AssayIn Vitro ModelBlood-retinal Barrier PermeabilityVascular BiologyEye ResearchBrain ResearchBlood-brain BarrierTEER MeasurementCell CultureHuman Retinal Microvascular Endothelial CellsHRMECsCell SeedingCell Culture Filter InsertsGelatin Coating
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Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F., Maurya, M., Blomfield, A. K., Tomita, Y., Chen, J. Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability. J. Vis. Exp. (184), e64076, doi:10.3791/64076 (2022).
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