Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

İç Kan-Retinal Bariyer Geçirgenliğini Değerlendirmek için In Vitro Model Olarak Endotel Hücre Transsitozu Testi

Published: June 7, 2022 doi: 10.3791/64076
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerinin kaveola aracılı transsellüler taşıma süreçlerinde yaban turpu peroksidazını hücreler arasında taşıma yeteneğini ölçerek iç kan-retinal bariyer geçirgenliğini değerlendirmek için bir model olarak in vitro endotel hücre transsitozu testini göstermektedir.

Abstract

Kan-retina bariyerinin (BRB) işlev bozukluğu, sıklıkla retinal ödem ve ardından görme kaybına neden olan çeşitli vasküler göz hastalıklarının patofizyolojisine katkıda bulunur. İç kan-retina bariyeri (iBRB) esas olarak fizyolojik koşullar altında düşük geçirgenliğe sahip retinal vasküler endotelden oluşur. Düşük geçirgenliğin bu özelliği, bitişik retinal mikrovasküler endotel hücreleri arasındaki düşük parasellüler taşıma oranları ve ayrıca bunlar aracılığıyla transsellüler transport (transsitoz) ile sıkı bir şekilde düzenlenir ve korunur. Retinal transsellüler bariyer geçirgenliğinin değerlendirilmesi, sağlık ve hastalıkta iBRB bütünlüğü hakkında temel bilgiler sağlayabilir. Bu çalışmada, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerini (HRMEC'ler) kullanarak iBRB geçirgenliğini değerlendirmek için in vitro bir model olarak endotel hücresi (EC) transsitoz testi tanımlanmıştır. Bu tahlil, HRMEC'lerin sırasıyla reseptör ve kaveola aracılı transsellüler transport süreçlerinde transferrin ve yaban turpu peroksidazını (HRP) taşıma yeteneğini değerlendirir. Gözenekli membran üzerinde kültürlenen tam akışkan HRMEC'ler, EC monokatmanındaki transsitoz seviyelerinin göstergesi olarak, alt odaya aktarılan transferrin veya HRP seviyelerini ölçmek için floresan etiketli transferrin (klatrin bağımlı transsitoz) veya HRP (kaveola aracılı transsitoz) ile inkübe edildi. iBRB'yi düzenleyen bilinen bir yol olan Wnt sinyali, kaveola aracılı HRP bazlı transsitoz testi yöntemini göstermek için modüle edildi. Burada açıklanan EC transsitoz testi, vasküler patolojilerde EC geçirgenliğinin ve iBRB bütünlüğünün moleküler düzenleyicilerini araştırmak ve ilaç dağıtım sistemlerini taramak için yararlı bir araç sağlayabilir.

Introduction

İnsan retinası, vücuttaki en yüksek enerji gerektiren dokulardan biridir. Nöral retinanın düzgün çalışması, retinal çevreyi korumak için kan-retinal bariyer (BRB) aracılığıyla aracılık edilen diğer potansiyel olarak zararlı moleküllerin sınırlı bir akışı ile birlikte verimli bir oksijen ve besin kaynağı gerektirir1. Merkezi sinir sistemindeki kan-beyin bariyerine (BBB) benzer şekilde, BRB gözde seçici bir bariyer görevi görür ve iyonların, suyun, amino asitlerin ve şekerin retinanın içindeki ve dışındaki hareketini düzenler. BRB ayrıca bağışıklık hücreleri, antikorlar ve zararlı patojenler gibi dolaşım faktörlerine maruz kalmayı önleyerek retinal homeostazı ve bağışıklık ayrıcalığını korur2. BRB disfonksiyonu, diyabetik retinopati, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), prematüre retinopatisi (ROP), retinal ven tıkanıklığı ve üveit gibi çeşitli vasküler göz hastalıklarının patofizyolojisine katkıda bulunur ve vazojenik ödem ve ardından görme kaybına neden olur 3,4,5.

BRB, sırasıyla iki ayrı oküler vasküler ağ için iki ayrı bariyerden oluşur: retina vaskülatürü ve retinanın altındaki federe koryokapillaris. İç BRB (iBRB) esas olarak retinal nöronal tabakaları besleyen retinal mikrovasküler endotel hücrelerinden (RMEC'ler) oluşur. Öte yandan, retinal pigment epiteli, nörosensoriyel retina ve koryokapillaris2 arasında yer alan dış BRB'nin ana bileşenini oluşturur. iBRB için, RMEC'ler arasında moleküler taşıma hem parasellüler hem de hücreler arası yollardan gerçekleşir (Şekil 1). iBRB boyunca yüksek derecede madde seçiciliği, (i) bitişik endotel hücreleri (ECs) arasındaki parasellüler taşımayı kısıtlayan bileşke protein komplekslerinin varlığına ve (ii) endotel hücreleri içindeki düşük transsellüler arası taşıma oranlarını koruyan kaveola mediatörlerinin, taşıyıcılarının ve reseptörlerinin düşük ekspresyon seviyelerine dayanır 1,6,7,8 . Parasellüler akıyı düzenleyen kavşak kompleksleri, suyun ve küçük suda çözünür bileşiklerin geçişine izin veren sıkı kavşaklardan (klodinler, oklüdinler), ader kavşaklardan (VE kadherinler) ve boşluk kavşaklarından (konneksinler) oluşur. Küçük lipofilik moleküller RMEC'lerin iç kısmına pasif olarak yayılırken, daha büyük lipofilik ve hidrofilik moleküllerin hareketi, veziküler transport ve membran taşıyıcıları dahil olmak üzere ATP güdümlü trans-endotel yolları tarafından düzenlenir 5,9.

Veziküler transsitoz, kaveolin aracılı kavooler transsitoz, klatrin bağımlı (ve reseptör aracılı) transsitoz ve klatrin bağımsız makropinositoz olarak sınıflandırılabilir (Şekil 2). Bu veziküler taşıma işlemleri, makropinozomlar en büyük (200-500 nm arasında değişen) ve kaveoller en küçüğü (ortalama 50-100 nm) olan farklı büyüklükteki vezikülleri içerirken, klatrin kaplı veziküller 70-150 nm10 arasında değişmektedir. Kaveolalar, esas olarak lipit membran kolesterolünü ve diğer yapısal ve sinyal proteinlerini kaveolin-iskele alanları 11 aracılığıyla bağlayan kaveolin-1'den oluşan bir protein kaplaması ile şişe şeklinde lipit bakımından zengin plazma membran invaginasyonlarıdır11. Kaveolinler, plazma zarı12'de kaveola stabilizasyonunu teşvik etmek için periferik olarak bağlı kavain ile birlikte çalışır. Kaveoler membranlar ayrıca endotel hücreleri arasındaki hareketlerine yardımcı olmak için insülin, albümin ve yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) ve düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) dahil olmak üzere dolaşımdaki lipoproteinler gibi diğer moleküller için reseptörler taşıyabilir13. Gelişim sırasında, fonksiyonel BRB oluşumu EC transsitoz8'in baskılanmasına bağlıdır. Bu nedenle, olgun retinal endotel, fizyolojik koşullar altında diğer endotel hücrelerine göre nispeten düşük seviyelerde kaveola, kaveolin-1 ve albümin reseptörlerine sahiptir ve bariyer özelliklerine katkıda bulunur 4,9.

iBRB parçalanması birçok patolojik göz rahatsızlığının önemli bir özelliği olduğundan, retinal vasküler geçirgenliği in vivo ve in vitro olarak değerlendirmek için yöntemler geliştirmek esastır. Bu yöntemler, tehlikeye atılmış BRB bütünlüğünün mekanizmaları hakkında olası bilgiler sağlamaya ve potansiyel terapötik hedeflerin etkinliğini değerlendirmeye yardımcı olur. Mevcut in vivo görüntüleme veya kantitatif vasküler kaçak tahlilleri tipik olarak floresan (sodyum floresein ve dekstran), kolorimetrik (Evans Blue boya ve yaban turpu peroksidaz [HRP] substratı) veya radyoaktif izleyiciler14 kullanarak vaskülatürden mikroskop görüntüleme ile veya izole doku lizatında çevredeki retinal dokulara ekstravazasyonu tespit eder. Vasküler bütünlüğü ölçmek için ideal bir izleyici, sağlıklı ve sağlam kılcal damarlarla sınırlıyken tehlikeye girmiş damarlara serbestçe nüfuz edecek kadar inert ve büyük olmalıdır. Canlı fundus floresein anjiyografide (FFA) sodyum floresein veya floresein izotiyosiyanat-konjuge dekstran (FITC-dextran) veya izole retinal düz montajlarda kullanılan yöntemler, retinal ekstravazasyonun in vivo veya ex vivo olarak ölçülmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. FITC-dextran, boyut seçici çalışmalar için 4-70 kDa arasında değişen farklı moleküler ağırlıklarda bulunma avantajına sahiptir15,16,17. FITC-albümin (~ 68 kDa), vasküler sızıntı çalışmaları için biyolojik açıdan uygun alternatif bir büyük boyutlu protein izleyicisidir18. İntrakardiyalolarak 19, retro-orbital veya kuyruk damarı 20 yoluyla enjekte edilen Evans Blue boyası, çoğunlukla spektrofotometrik tespit veya daha az yaygın olarak, düz montajlarda floresan mikroskobu ile ölçülebilen büyük bir molekül oluşturmak için endojen albümin ile bağlanmasına da dayanır20,21. Bununla birlikte, bu kantitatif veya hafif görüntüleme metodolojileri genellikle parasellüler transportu trans-endotelyal transporttan ayırmaz. Transsitozlu veziküllerin ultrastrüktürel görselleştirmesi ile transsitozun spesifik analizi için, HRP gibi izleyici moleküller tipik olarak bir elektron mikroskobu22,23,24 altında gözlemlenebilen endotel hücreleri içindeki transsitozlu vezikülleri bulmak için kullanılır (Şekil 3A-C).

Endotel hücre geçirgenliğini değerlendirmek için in vitro iBRB modellerinin geliştirilmesi ve kullanılması, in vivo deneyleri tamamlamak ve vasküler sızıntının moleküler düzenleyicilerinin araştırılmasına yardımcı olmak için sağlam ve yüksek verimli bir değerlendirme sağlayabilir. Sıkı kavşakların parasellüler transportunu ve bütünlüğünü değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan testler arasında trans-endotelyal elektriksel direnç (TEER), iyonik iletkenlik ölçüsü (Şekil 4) 2,25 ve küçük moleküler ağırlıklı floresan izleyiciler kullanılarak in vitro vasküler sızıntı testi26 bulunmaktadır. Ek olarak, klatrin bağımlı transsitoz27'yi araştırmak için BBB'yi modelleyen transferrin bazlı transsitoz tahlilleri kullanılmıştır. Buna rağmen, BRB'yi ve daha spesifik olarak retinal EC kaveoler transsitozunu in vitro olarak değerlendirmek için yapılan testler sınırlıdır.

Bu çalışmada, iBRB geçirgenliğini ve EC transsitozunu belirlemek için in vitro model olarak insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerinin (HRMEC'ler) kullanıldığı bir EC transsitoz testi tanımlanmıştır. Bu tahlil, HRMEC'lerin sırasıyla reseptör aracılı veya kaveola bağımlı transsitoz yolları aracılığıyla transferrin veya HRP'yi taşıma yeteneğine dayanır (Şekil 2). Apikal odada (yani filtre ekinde) tam akıcılığa kadar kültürlenmiş HRMEC'ler, sadece EC transsitozu yoluyla alt odaya aktarılan transferrin veya HRP seviyelerine karşılık gelen floresan yoğunluğunu ölçmek için floresan konjuge transferrin (Cy3-Tf) veya HRP ile inkübe edildi. Hücre tek katmanının akıcılığı, sıkı bağlantı bütünlüğünü gösteren TEER ölçülerek doğrulanabilir25. TEER ve transsitoz testi tekniğini göstermek için, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF)28 ve Wnt sinyallemesindekiler (Wnt ligandları: Wnt3a ve Norrin)29 dahil olmak üzere vasküler geçirgenlik ve EC transsitozunun bilinen moleküler modülatörleri kullanılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri, Boston Çocuk Hastanesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından ışık mikroskobu ve EM görüntülerinin oluşturulması için onaylanmıştır (Şekil 3). İn vivo çalışmalar için protokoller Wang ve ark.24'ten elde edilebilir. İnsan retinal mikrovasküler endotel hücrelerini (HRMEC'ler) içeren tüm deneyler, Boston Çocuk Hastanesi'ndeki Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) tarafından onaylanmıştır.

1. Reaktiflerin Hazırlanması

  1. Doku kültürü kabının kaplanması için çözelti: 500 mL steril doku kültürü sınıfı 1x PBS'de (pH = 7.4) 1 mL jelatin stok çözeltisini (% 40 -% 50) çözerek% 0.1 jelatin çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi 0,22 μm'lik bir filtreden süzün. % 0.1 jelatin çözeltisini 2-8 ° C'de saklayın. Söz konusu sıcaklıkta steril bir durumda belirsiz bir süre saklanabilir.
  2. Büyüme ortamı: EGM takviyelerini üreticinin talimatlarına göre endotel hücre büyüme bazal ortamına (EBM) çözerek 500 mL endotel hücre büyümesi tam ortamı (EGM) hazırlayın (Malzeme Tablosu). Aliquot büyüme ortamı 50 mL tüplere dönüşür ve tüpleri 4 ° C'de saklar. Büyüme ortamının raf ömrü 4 °C'de 12 aydır.
  3. Tripsin çözeltisi:% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi için, stok şişesinden 50 mL tüplere aliquot yapın ve 4 ° C'de (2 haftaya kadar) veya -20 ° C'de (24 aya kadar) saklayın.

2. HRMEC'lerin Kültürlenmesi

  1. İlk hücre kültürü
    1. Laminer akış davlumbazının altında 5 mL %0,1 jelatin çözeltisi içeren Petri haznelerini (100 mm çap x 20 mm yükseklik) kaplayın ve homojen kaplama için oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca davlumbazda bozulmadan tutun.
      NOT: Bulaşıkların jelatin kaplaması hücre bağlantısını arttırır. Alternatif olarak, jelatin kaplı T75 kültür şişeleri de kullanılabilir.
    2. Hücreleri tohumlamadan önce, bir vakum pompası kullanarak jelatin çözeltisini aspire edin. Kullanılan aspiratörün vakum basıncı 724 mmHg'ye kadar çıktı.
      NOT: Kaplama çözeltisinin kurumasını önlemek için aspirasyon, tohumlama hücrelerinden hemen önce yapılmalıdır.
    3. Dondurulmuş bir HRMEC şişesini (sıvı azotta depolamadan) 37 ° C'de bir su banyosu kullanarak veya şişeye ılık bir büyüme ortamı ekleyerek çözün. Çözüldükten sonra, hücre süspansiyonunu 9 mL büyüme ortamına aktarın (HRMEC'lerin çözülmüş şişesinin 1 mL olduğu varsayılarak).
      NOT: HRMEC'ler ticari olarak elde edilmiştir (Malzeme Tablosu). Hücrelere eklenen büyüme ortamı, kullanımdan önce daima 37 ° C'ye ısıtılmalıdır.
    4. RT'de 5 dakika boyunca hücreleri 200 x g'de döndürün ve hücre peletini çıkarmamak için süpernatantı dikkatlice aspire edin.
    5. Hücre peletini 10 mL büyüme ortamında yeniden askıya alın ve elde edilen süspansiyonu jelatin kaplı bir Petri kabına aktarın. İnkübatördeki hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de tutun. Tipik olarak, HRMEC'ler 72 saat sonra% 70 -% 80 oranında akıcıdır.
      NOT: Büyüme ortamı her geçen gün değiştirilir.
  2. HRMEC'lerin geçirgen membran uçları üzerindeki alt kültürü
    1. HRMEC'leri tohumlamak için hücre kültürü filtre ekleri (0,4 μm gözenek boyutunda polikarbonat membranlı 6,5 mm'lik kesici uçlar, 24 delikli bir plakaya yerleştirilmiş) hazırlayın ve her bir kesici ucu (apikal oda) laminer bir akış başlığı altında 30 dakika boyunca 200 μL %0,1 jelatin çözeltisi ile kaplayın. Çözeltinin filtre ekinin tüm alt yüzeyini kapladığından emin olun.
      NOT: Her kuyucuk, gözenekli bir membranla ayrılmış apikal ve bazolateral bir odaya sahiptir.
    2. Petri kabını kültürlü HRMEC'lerle (adım 2.1.5.) inkübatörden çıkarın ve büyüme ortamını aspire edin. Potansiyel yüzen / ölü hücrelerden kurtulmak için hücreleri laminer bir akış başlığı altında 10 mL 1x PBS ile 2x hafifçe durulayın.
    3. Hücreleri 0.5-1 mL% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ile ayırın ve Petri kabını 5 dakika boyunca inkübatöre (37 ° C ve% 5 CO2) yerleştirin.
    4. 4.5-9 mL büyüme ortamı ekleyerek tripsin aktivitesini söndürün ve hücre süspansiyonunu 10 mL'lik bir pipet kullanarak 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
    5. RT'de 5 dakika boyunca hücreleri 200 x g'de döndürün, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti 3 mL büyüme ortamında yeniden askıya alın.
    6. Manuel hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın ve filtre eki başına 4 x 104 hücre yoğunluğunda tohumlayın (yani, 1.25 x 105 hücre /cm2). Her kesici uç için hücre süspansiyonunun hacmi 250 μL'dir.
    7. Kaplama çözeltisini geçirgen kesici uçlar içeren kuyucuklardan aspire edin ve kesici uç başına hücre süspansiyonunun 250 μL'sini aktarın (apikal oda). Kesici uçlardan birine yalnızca ortam (yani hücreler olmadan) ekleyin ve bu da TEER ölçümü için "boş kontrol" olarak kullanılacaktır. Aynı zamanda, bazolateral odalarda kuyu başına 750 μL ortam ekleyin.
    8. Geçirgen uçlara sahip 24 delikli plakayı, kültürlenmiş hücreler tamamen kaynaşıncaya ve istenen ~20 Ω · cm2 TEER değerine ulaşılana kadar 7-12 gün boyunca inkübatörde (37 ° C ve% 5 CO2) tutun.
    9. Büyüme ortamını her geçen gün değiştirin. Ortam değişimi sırasında, hücre tek katmanının bozulmasını en aza indirmek için ortamı dikkatlice aspire edin ve apikal ve bazolateral odalara sırasıyla kuyucuk başına 250 μL ve 750 μL taze ortam ekleyin.
      NOT: Büyüme ortamı, kuyuların hem apikal hem de bazolateral odaları için değiştirilir.

3. TEER ölçümleri (Şekil 4)

  1. 14. günde hücre tohumlama sonrası (adım 2.2.9.), HRMEC'ler için TEER'yi epitel volt-ohm metre (EVOM) elektriksel direnç (ER) sistemi (Malzeme Tablosu) kullanarak aşağıdaki gibi ölçün.
  2. ER sistemini önceden şarj edin ve STX04 test elektrodunu kullanarak ölçüm cihazının işlevselliğini kontrol edin. Gerekirse kalibre edin.
  3. Elektrodu sayaca bağlayın ve elektrodu önce 15-20 dakika boyunca% 70 etanol içine batırarak ve daha sonra hücre kültürü EGM büyüme ortamına kısaca batırarak dengeleyin.
  4. Bu arada, sıcaklık dengesi için hücre içeren 24 delikli plakayı RT'deki laminer akış davlumbazında 15-20 dakika tutun.
    NOT: TEER ölçümleri sıcaklıktan etkilenir, bu nedenle dengeleme adımı esastır.
  5. TEER ölçümü için, kuyuların hem apikal (250 μL) hem de bazolateral (750 μL) odalarına taze büyüme ortamı ekleyin.
  6. Elektrotu, kısa uç kesici uçta olacak ve daha uzun uç kuyucuğun dibine değecek şekilde dikkatlice daldırarak TEER ölçümü gerçekleştirin. Önce boş kontrol boyunca direnci ölçün. Her kesici uç için TEER'i üçlü olarak ölçün.
    NOT: Ölçümler arasında elektrodu durulamak için kültür ortamı kullanılır. Sabit okumalar için elektrotun kesici ucun altına 90° açıyla tutulduğundan emin olun.
  7. TEER = net direnç (Ω) x filtre ekinin yüzey alanı (cm2) formülünü kullanarak tek katman boyunca elektrik direncini (Ω·cm2 cinsinden) hesaplayın; burada net direnç, her bir kuyucuğun direnci (hücrelerle büyüme ortamı) ile boş kuyu (sadece büyüme ortamı) arasındaki farktır.
  8. Hücrelerin daha fazla tedavisini ancak TEER değeri ~ 20 Ω · cm2'ye ulaştıktan sonra gerçekleştirin. İstenilen TEER seviyesine ulaşılamazsa, plakayı inkübatörde tutun ve ertesi gün TEER'yi ölçün.
    NOT: HRMEC akıcılığı, tipik parke taşı morfolojisi ile hücre şeklinin morfolojik incelemesi (mikroskop altında) ve / veya immünohistokimya boyaması ile ayrı ayrı hücre bağlantı proteinlerinin varlığı ile de doğrulanabilir.

4. Transsitoz testi

  1. Cy3 etiketli transferrin kullanılarak klatrin aracılı in vitro transsitoz testi (Şekil 5)
    1. 20 Ω·cm2 civarında TEER değerleri ile akıcılığa ulaştıktan sonra, serum, ligand ile tedaviden önce her iki odacıkta (apikal oda:250 μL ve bazolateral odacık: 750 μL) EBM'de (serum indirgenmiş ortam) %0.5 FBS kullanarak hücreleri 37 °C'de 24 saat ve %5 CO 2 ile mahrum bırakır. Serum azaltılmış EBM tahlil boyunca kullanıldı.
    2. Apikal odadaki hücreleri (adım 4.1.1'de serum indirgenmiş ortamı kullanarak), floresan (siyanin 3) etiketli transferrin ligand (Cy3-Tf) (40 μg / mL'lik son konsantrasyon) ile 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Cy3-Tf içeren plakalar, alüminyum folyoya sarılarak ve deneyi ışıklar kapalıyken bir hücre kültürü davlumbazında gerçekleştirerek Cy3-Tf'nin fotobeyazlatmasını önlemek için ışıktan korunmalıdır.
    3. 1 saat sonra, plakayı buz üzerine yerleştirin ve serbest bağlanmamış Cy3-Tf'yi çıkarmak için tek katmanlı apikal ve bazolateral olarak 4x (yıkama başına 3-5 dakika) RT'de serum azaltılmış ortamla yıkayın.
      NOT: Serbest izleyici moleküllerini çıkarmak ve parasellüler yoldan potansiyel sızıntı olmadan transsitozun doğru okunmasını sağlamak için yıkama şarttır.
    4. Hücre içeren iyice yıkanmış filtre eklerine taze serum azaltılmış ortam (adım 4.1.1'de olduğu gibi.) ekleyin ve kesici uçları, önceden ısıtılmış serum indirgenmiş ortam içeren 24 delikli plakanın taze kuyucuklarına aktarın.
    5. Hücreleri inkübatörde 90 dakika daha (37 ° C ve% 5 CO2) inkübe edin ve ardından ortamı bazolateral odadan toplayın.
    6. Bir floresan dedektörü kullanarak çözeltinin floresan yoğunluğunu bazolateral odadan kaydedin. Göreceli floresan birimleri (RFU) olarak ölçülen floresan yoğunluğu seviyeleri, klatrin bağımlı transsitoz yoluyla HRMEC tek katmanı boyunca transsitozlanan Cy3-Tf kompleksinin miktarını gösterir.
  2. HRP kullanılarak kaveola aracılı in vitro transsitoz testi (Şekil 6)
    1. 20 Ω· cm2 civarında TEER değerleri ile tam akıcılığa ulaştıktan sonra, serum tedaviden önce (adım 4.1.1'de olduğu gibi) % 0.5 FBS içeren EBM ortamı (serum indirgenmiş ortam) kullanarak, 37 ° C'de24 saat ve% 5 CO 2 için hücreleri mahrum eder. Serumla indirgenmiş EBM ortamı tüm tahlil boyunca kullanıldı.
    2. Apikal odadaki hücreleri istenen tedaviler ve araç kontrolleri ile tedavi edin.
      NOT: Burada, HRMEC'lerde Wnt sinyal yolu tarafından kaveola aracılı transsitozun düzenlenmesini göstermek için Wnt modülatörlerini örnek olarak kullandık: insan rekombinant Norrin ve Wnt inhibitörü XAV939. Tipik bir deneyde, hücreler aşağıdaki konsantrasyonlarla bir inkübatörde (37 ° C ve% 5 CO2) 24 saat boyunca tedavi edildi: Norrin (125 ng / mL), Norrin (125 ng / mL) + XAV939 (10 μM) ve araç kontrol çözeltisi. Ek olarak, Wnt3a şartlandırılmış ortam (L Wnt-3A hücrelerinden üretilen) de kullanılmıştır.
    3. Apikal odadaki hücreleri HRP (5 mg / mL) ile 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
    4. Daha sonra, 24 delikli plakayı buzun üzerine yerleştirin ve serbest hücre dışı HRP'yi çıkarmak için apikal ve bazolateral odaları P tamponu (10 mM HEPES pH = 7.4, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM glikoz, 3 mM CaCl2, 145 mM NaCl) ile yoğun bir şekilde 6x yıkayın.
      NOT: Serbest izleyici moleküllerini çıkarmak ve parasellüler yoldan potansiyel sızıntı olmadan transsitozun doğru okunmasını sağlamak için yıkama şarttır.
    5. Apikal hazneye taze serum azaltılmış ortam (adım 4.1.1'de olduğu gibi.) ekleyin ve kesici uçları önceden ısıtılmış ortam içeren taze bir kuyuya aktarın.
    6. Ortamı bazolateral odadan toplamadan önce tek katmanı inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 90 dakika daha inkübe edin.
    7. Toplanan ortama, üreticinin talimatlarına göre 100 μL HRP florojenik peroksidaz substratı (Malzeme Tablosu) ekleyin ve 100 μL Stop çözeltisi ile reaksiyonu durdurmadan önce RT'de 10 dakika inkübe edin.
    8. Bir floresan plaka okuyucu kullanarak ortamdaki HRP substrat reaksiyon ürününün seviyelerini tespit edin. Floresan yoğunluğunu 420 nm emisyon dalga boyunda (325 nm uyarma ile) ve göreceli floresan birimleri (RFU) olarak ölçün. Değerler, kaveola aracılı transsitoz yoluyla HRMEC tabakası boyunca transsitoz edilen HRP seviyesini gösterir.
      NOT: Burada kullanılan floresan ürün (Malzeme Tablosu) fotobeyazlatıcı değildir. Fotobeyazlatmaya karşı ışık koruması gerekli değildir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Retinal vasküler endotelin EM görüntülerinde transsitotik veziküler transportu ve endotel hücrelerinde kavoler veziküller in vivo olarak görülmektedir.
EC transsitoz, retinal kesitler içinde, HRP içeren kan damarlarını yansıtan koyu kahverengi çökelti ile ışık mikroskobu altında (Şekil 3A) ve HRP içeren transsitotik veziküllerin göstergesi olan elektron yoğun çökelti olarak (Şekil 3B, C) transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak in vivo olarak görselleştirilebilir, böylece iBRB boyunca EC transsitozu gösterilir. Büyük veziküller potansiyel olarak makropinositozu yansıtır (beyaz ok ucu; Şekil 3B) ve küçük veziküller muhtemelen kavolar vezikülleri (beyaz ok uçları; Şekil 3C). Ayrıca, retinal kan damarlarında kaveollerin lokalizasyonu, kaveola belirteci CAV-1 antikorunun, floresan mikroskobu altında kan damarında izolektin (EC belirteci) ile birlikte boyanması olarak görülebilir (Şekil 3D). CAV-1 pozitif kavoler veziküller TEM altında immünogold etiketli CAV-1 antikorları (siyah noktalar; Şekil 3E) retinal vasküler endotel hücreleri içinde. İn vivo çalışmalar için protokoller Wang ve ark.24'ten elde edilebilir.

VEGF tedavisi, trans-endotelyal elektrik direnci (TEER) ile ölçülen HRMEC'lerde vasküler geçirgenliği arttırır
EC transsitoz tahlilleri yapılmadan önce, HRMEC'ler, ışık mikroskobu altında gözlemlenebilen karakteristik parke taşı morfolojisini göstererek tam akıcılığa kadar kültürlenmelidir. Tam hücre akıcılığı, trans-endotelyal elektrik direnci (TEER) ölçümü (Şekil 4A) ile doğrulanabilir, okumalar konfluent HRMEC'ler30 için ~ 20 Ω ·cm2'ye ulaşır, bu da tek katman boyunca dar veya boşluklu kavşaklar yoluyla düşük seviyelerde parasellüler transportu düşündürür. TEER ölçümünü göstermek için vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) örnek olarak kullanılmıştır. HRMEC'lerin VEGF ile tedavisi, artan HRMEC geçirgenliğini yansıtan TEER seviyelerini önemli ölçüde azaltmıştır (Şekil 4B). Kontrol hücrelerinde, potansiyel olarak kültür süresi ve hücrelere zarar verebilecek farklı zaman aralıklarında alınan çoklu ölçümler nedeniyle TEER değerlerinde bir azalma gözlenmiştir31.

HRMEC'lerde klatrin aracılı EC transsitozunu değerlendirmek için Cy3-transferrin taşınması kullanılabilir
Klatrin aracılı EC transsitozu için, gözenekli membran üzerinde kültürlenen konfluent HRMEC'ler, ECs boyunca taşınmasını tespit etmek için floresan (Cy3) etiketli transferrin ile inkübe edildi (Şekil 5A). Bu tahlil, transferrin taşınmasının reseptör aracılı bir transsitoz süreci olduğu gerçeğinden yararlanmaktadır. Cy3-transferrin endositozu (kırmızı), nükleer boya, DAPI (mavi) (Şekil 5B) ile birlikte boyanmış HRMEC tek katmanlı olarak gözlendi ve hücrelere alımını doğruladı. (Cy3) etiketli transferrinin floresan yoğunluğu, endositoz sürecini değerlendirmek için görüntülerden ölçülebilir ve / veya klatrin aracılı transsitoz27 seviyelerini ölçmek için kuyucukların bazolateral odasından toplanan ortamdan ölçülebilir.

Wnt sinyal yolu, HRP tabanlı bir tahlilde HRMEC'ler arasında kaveola aracılı EC transsitozunu düzenler
Daha önce, Wnt sinyalizasyonunun, iBRB24'ü korumak için retinal vasküler EC'lerde MFSD2A'ya bağımlı kakolola aracılı transsitozu düzenlediği bulunmuştur. Wnt modülatörlerinin etkileri HRP tabanlı in vitro transsitoz testinde değerlendirildi (Şekil 6A). Tam konfluent HRMEC'ler Wnt yol aktivatörleri ile tedavi edildi: Wnt3a şartlı ortam (Wnt3a-CM) veya insan rekombinant Norrin, Wnt / β-katenin sinyal inhibitörü XAV939 olsun veya olmasın ve HRMEC'ler arasında transsitozlu HRP seviyeleri tespit edildi. Wnt3a-CM veya Norrin ile tedavi, azalmış kavoler transsitozun göstergesi olan transsitozlu HRP düzeylerinde önemli ölçüde azalma olduğunu ortaya koymuştur. Ek olarak, Wnt sinyal inhibitörü XAV939 ile kombine tedavi, HRMEC'lerde transsitozlu HRP'nin yukarı regüle seviyelerini göstermiştir, bu nedenle Wnt aktivatörlerinin HRMEC geçirgenliği üzerindeki etkilerini ortadan kaldırmıştır (Şekil 6B, C)24.

Figure 1
Şekil 1: Retinal vasküler endotel boyunca farklı taşıma yolları. Retinal mikrovasküler endotel hücreleri (RMEC'ler) arasında farklı moleküler akı yollarını gösteren şematik çizim. İç kan-retinal bariyer içindeki retinal vasküler endotel hücreleri arasında taşıma iki ana yolla gerçekleşir: transsitoz dahil olmak üzere parasellüler ve transsellüler yollar. Bu rakam Yemanyi ve ark.5'in izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Endotel hücreleri arasında transsitotik veziküler transport yolaklarına genel bakış ve bunların in vitro değerlendirmesi. Endotel hücrelerinde (ECs), makromoleküllerin hücreler arası translokasyonu üç ana vezikül tipiyle gerçekleşir: kavoler veziküller (50-100 nm), klatrin kaplı veziküller (70-150 nm) veya klatrin bağımsız makropinozomlar (200-500 nm). Kaveoller, plazma zarında şişe şeklinde, küresel, lipit bakımından zengin mikrodomainlerdir ve kaveolin ve kavinlerden oluşur. Bu veziküller yoluyla transsitoz seviyeleri, iç kan-retinal bariyer (iBRB) geçirgenliğini değerlendirmek için sırasıyla kaveola aracılı transsitoz, klatrin aracılı transsitoz ve makropinositoz için floresan substrat, floresan etiketli transferrin (Cy3-Tf) veya tetrametilrodamin etiketli sığır serum albümini (TMR-BSA) ile kombine yaban turpu peroksidaz (HRP) kullanılarak EC kültüründe floresan bazlı in vitro tahlillerle belirlenebilir. Her yolun farklı özellikleri ve taşıma mekanizmaları olsa da, özellikle kaveolar transport ve makropinositoz arasında, her ikisi de klatrinden bağımsız olarak, örtüşen fonksiyon ve madde taşınması meydana gelebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Retinada EC transsitozunun görselleştirilmesi. (A) Işık mikroskobu görüntüsü, 3,3'-diamino benzidin (DAB) (siyah) ile boyanmış, 3 aylık vahşi tip (WT) fare retina bölümünden HRP dolgulu bir kan damarı lümenini göstermektedir. HRP, WT farelere retro-orbital olarak enjekte edildi, bunu göz izolasyonu ve doku gömme izledi. İnce kesitler, HRP'nin koyu kahverengi çökelti olarak kolorimetrik tespiti için elektron yoğun DAB substratı ile boyandı ve retinal kan damarı lümeninde HRP'yi ortaya çıkarmak için ışık mikroskobu altında görüntülendi. (B,C) Örnekler daha sonra HRP içeren transsitotik vezikülleri görselleştirmek için transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ultra ince kesitleme ile daha fazla işlendi ve iBRB boyunca EC transsitozunu tasvir etti. TEM görüntüleri, HRP dolu kan damarı lümeni ve RMEC'ler içinde HRP içeren veziküller bulunan 3 aylık bir WT farenin retinal bir bölümünü göstermektedir. (B) Ara sıra büyük bir vezikül, luminal tarafta kırmızı kan hücrelerinin (yıldız işareti) varlığı ile ECs içindeki makropinozomu (ok ucu) potansiyel olarak yansıtır. (C) Küçük veziküller muhtemelen kavoler veziküllerdir (ok uçları). (D) CAV-1 antikoru (yeşil) ve izolektinB4'ün (IB4, kırmızı, EC belirteci) immünohistokimya ile boyanması, 3 aylık WT fare retinasında (DAPI, mavi) retinal kan damarlarında CAV-1'in lokalizasyonunu göstermektedir. (E) Retinal ECs içindeki immünogold etiketli CAV-1'in (siyah noktalar, oklar) TEM görüntüsü; iç kısım, CAV-1 pozitif kavoler vezikülün büyütülmüş bir görüntüsünü gösterir. Kısaltmalar: HRP = yaban turpu peroksidaz; GCL = ganglion hücre tabakası; IPL = iç pleksiform tabaka; INL = iç nükleer tabaka; OPL = dış pleksiform tabaka; ONL = dış nükleer tabaka; RPE = retinal pigment epiteli; E = endotel hücresi; ve L = kan damarı lümeni. Büyütme: (A, D) 20x. Ölçek çubukları: (A) 50 μm, (B) 2 μm, (D) 100 μm ve (C,E) 200 nm. Panel (E), Wang ve ark.24'ün izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: VEGF tedavisinden sonra HRMEC'lerde tam uyumlu HRMEC'lerin ve artmış vasküler geçirgenliğin doğrulanması . (A) Trans-endotelyal elektriksel direnç (TEER) ölçümü için kuyucukların apikal ve bazolateral odalarındaki elektrotların konumlandırılmasını gösteren şematik diyagram, hücre monokatmanının vasküler geçirgenliği ve bütünlüğünün bir değerlendirmesi olarak. (B) Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ile önceden tedavisi olan ve olmayan tam konfluent HRMEC'lerin TEER kayıtlarını gösteren grafik. 18 saat (18 H) sonra VEGF ile tedavi, tam akışkan HRMEC'lerde TEER'in azalmasına neden olur31. s≤0.001. Panel (B) Tomita ve ark.31'in izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Transferrin (Tf) kullanan HRMEC'lerde klatrin aracılı EC transsitoz testinin şematik bir gösterimi. (A) HRMEC'ler, jelatin kaplı ekler üzerinde tam akıcılığa kadar büyütüldü ve serum, tahlilden önce 37 ° C'de bir gecede aç bırakıldı. Hücreler, 37 ° C'de 60 dakika boyunca floresan Cy3-konjuge transferrin (Cy3-Tf) ile apikal olarak inkübe edildi. Kuluçkadan sonra, hücreler bağlanmamış hücre dışı Cy3-Tf'yi çıkarmak için taze bir ortamla yoğun bir şekilde yıkandı. Taze ortam içeren ekler daha sonra bazolateral odada ılık ortam içeren yeni bir plakaya aktarıldı ve hücreler endositozlu Cy3-Tf'yi serbest bırakmak için 90 dakika daha 37 ° C'de inkübe edildi. Bazolateral odacıktan ortam toplanabilir ve klatrin bağımlı (Cy3-Tf) EC transsitozuna karşılık gelen floresan yoğunluğu, bir floresan plaka okuyucu kullanılarak ölçülebilir. (B) DAPI (mavi) ile boyanmış HRMEC'lerde endositozu doğrulayan Cy3-transferrin (kırmızı) gözlendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Wnt sinyali, in vitro HRP tabanlı bir tahlilde kaveola aracılı HRMEC transsitozunu düzenler . (A) Caveola aracılı transsitozu değerlendirmek için HRP tabanlı testi gösteren şematik illüstrasyon. Jelatin kaplı kesici uçlar üzerinde kültürlenen tam akışkan HRMEC'ler, tedaviden önce 37 ° C'de% 0.5 fetal sığır serumu (FBS) + EBM ortamında bir gecede aç bırakıldı. Apikal odadaki EC tek katmanı, 37 °C'de 24 saat boyunca istenen tedavi ile tedavi edildi. Daha sonra, hücreler 15 dakika boyunca 37 ° C'de yaban turpu peroksidaz (HRP) ile inkübe edildi ve serbest hücre dışı HRP'yi çıkarmak için yoğun bir şekilde yıkandı. Taze ortam içeren ekler daha sonra bazolateral odalarda ılık ortam içeren yeni bir plakaya aktarıldı ve hücreler 37 ° C'de 90 dakika daha inkübe edildi. Bazolateral odacıktan ortam toplandı ve HRP seviyeleri florojenik peroksidaz substratı ile reaksiyona sokularak ölçüldü. Kaveola aracılı EC transsitozuna karşılık gelen floresan, floresan plaka okuyucu kullanılarak ölçüldü. (B,C) Bu örnekte, hücreler Wnt yol modülatörleri ile muamele edilmiştir: Wnt3a şartlı ortam (Wnt3a-CM) veya kontrol koşullu ortamı (Ctrl-CM), insan rekombinant Norrin veya kontrol çözeltisi (Ctrl) ve Wnt / β-katenin sinyal inhibitörü (XAV939) veya araç kontrolü (araç) ile veya olmadan. HRMEC kaveoler transsitozu üzerine etkileri HRP tabanlı tahlilde değerlendirildi. Tedaviden sonra, bazolateral odaya transfer edilen HRP seviyeleri ölçüldü ve HRMEC'ler arasında kavola aracılı EC transsitoz seviyeleri gösterildi. Wnt aktivatörleri, XAV939 tarafından tersine çevrilen HRP bazlı transsitoz seviyelerini azalttı. * s≤0.05, ** p≤0.01. Paneller (B) ve (C) Wang ve ark.24'ün izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BRB, retina sağlığı ve hastalığında önemli bir rol oynar. Vasküler geçirgenliği değerlendiren in vitro tekniklerin, bariyer (BRB/BBB) gelişimi ve fonksiyonu ile ilgili çalışmalarda çok önemli araçlar olduğu kanıtlanmıştır. Burada açıklanan prosedür, EC transsitozunun altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek veya BRB geçirgenliğini etkileyen ilgili moleküler modülatörleri değerlendirmek için kullanılabilir. İn vitro EC transsitoz tahlilleri, in vivo testlere veya vasküler geçirgenliği değerlendirmek için kullanılan tekniklere göre birçok avantaja sahiptir. Yüksek verimle hızlı bir şekilde performans gösterirler ve hem genetik hem de farmakolojik modülasyon ile birçok farklı değişkenin veya spesifik sinyal yollarının izole moleküllerinin etkilerini analiz etmek için kullanılabilirler. Saf EC kültür sistemi, sıklıkla in vivo olarak gözlendiği gibi hayvan varyasyonunu ortadan kaldırır ve ayrıca hedef moleküllerin diğer hücre tipleri tarafından olası modifikasyonunun veya endositozunun etkilerini sınırlar32. HRMEC hücrelerinin taşınması kolaydır, çoğu laboratuvarda bulunan temel hücre kültürü ekipmanı gerektirir ve hücre kültürü genellikle in vivo hayvan deneylerine kıyasla daha uygun maliyetlidir. İn vitro transsitoz tahlilleri in vivo fizyolojik koşulları tam olarak kopyalamasa da33, in vivo çalışmaları tamamlamak ve BRB kontrolü hakkındaki bilgimizi ilerletmek için değerli araçlar olabilirler.

Filtre ekinin gözenek boyutu, substrat tipi ve hücre tohumlama yoğunluğu dahil olmak üzere birçok önemli teknik parametre dikkate alınmalıdır. Geçirgen filtre eklerinin daha büyük bir gözenek boyutu, istenmeyen göçe ve kesici ucun alt tarafındaki hücrelerin büyümesine neden olarak ortaya çıkan ölçümü ve yorumlanmasını karıştırabilir. Bu eğilim farklı hücre tiplerine göre değişebilse de, gözenek çapları ≤1 μm, ECs34 de dahil olmak üzere çoğu hücre tipi için iyi hizmet eder. Uygun bir substrat seçimi ikinci önemli bir adımdır, çünkü bazı hücreler gözenekli substratta yetiştirildiğinde ve her iki taraftaki bir kültür ortamında yıkandığında daha yüksek polarite ve daha fazla farklılaşma gösterir35,36. İşlenmiş mikro gözenekli polikarbonat filtreler ECs için daha iyi bir alternatiftir, çünkü daha incedirler ve immünotahliller35 için minimum arka plan floresansı ile reaktiflerin tek katmanın bazolateral bölgesine daha fazla erişimini sağlarlar. Son olarak, tamamen akıcı bir tek katman elde etmek için, hücre tohumlama yoğunluğu, belirli hücre tipine göre optimize edilmelidir. Çok düşük tohumlama yoğunluğu farklılaşma durumunu etkileyebilirken, çok yüksek tohumlama yoğunluğu, diğer taraftan, tek katman yerine birden fazla hücre katmanı oluşturan hücrelerin hızla bağlanmasını destekleyebilir, sonunda hücresel morfolojiyi değiştirebilir ve yanlış transsitozölçümüne neden olabilir 37.

EC tek katmanının oluşumu ve bütünlüğü bu analiz için çok önemlidir ve istenen TEER'nin elde edilmesini sağlamak için TEER değerleri ölçülerek doğrulanabilir. Boş bir kontrol, yani hücresiz bir filtre eklentisi, hücre eklerinden çıkarılacak geçirgen membran boyunca bazal direnç seviyelerini ölçmek için her zaman dahil edilmelidir. Sıcaklık, hücre geçiş sayısı, kültür ortamının bileşimi, kültür süresi ve birleşim uzunluğu değişiklikleri gibi çeşitli faktörlerin tümü TEER değerlerinde küçük değişikliklere neden olabilir 25,38,39. TEER değerleri ayrıca VEGF gibi bazı tedavilerden de büyük ölçüde etkilenir. Başlangıçta damar geçirgenliğinin güçlü bir indükleyicisi olarak keşfedilen VEGF, parasellüler transportu düzenleyerek, yani sıkı bağlantı proteinleri ZO-1, oklüdinin fosforilasyonu ve sıkı bağlantı proteini claudin-5 41,42'nin yanı sıra hücreler arası transportun bozulması yoluyla vaskülergeçirgenliği etkiler43 . Tek katmanlı oluşumun ek doğrulaması, morfolojik inceleme ve boyama ile karakteristik bağlantı proteinlerinin varlığı ile yapılabilir. Kültür boyunca, hücreleri ideal pH aralığı ve besin mevcudiyeti ile optimum kültür durumunda tutmak için hem apikal hem de bazolateral odalarda düzenli aralıklarla ortamın değiştirilmesi önerilir.

Bu tahlili kullanan araştırmacılar, beyin ve retinal ECs'nin kritik bir doğal özelliğine dikkat etmelidir: BBB44'ün ve benzer şekilde BRB'nin hücresel bir özelliği olan apikobazal polarite. Transsitozun yönü, ilgilenilen protein hedef reseptörlerinin göreceli dağılımı ve EC membranının apikal / luminal ve bazolateral / abluminal alanlarındaki ilişkili transsitoz makineleri ile belirlenir. Beyin ve retinal EC'ler hem apikal/luminal hem de bazolateral/abluminal membranlardan birçok faktörü serbest bırakabilir44. Transferrinin klatrin bağımlı transsitozu, ilginç bir şekilde, çoğunlukla kan tarafından beyne veya retinaya tek yönlü olarak ortaya çıkar, çünkü transferrin reseptörleri ağırlıklı olarak apikal / luminal membran45 üzerinde bulunur. Kavoler transsitoz ise çift yönlü olarak ortaya çıkar ve vezikül yükünün lokalizasyonuna ve reseptörlerine bağlı olarak apikal/luminal veya bazolateral/abluminal membrandan ve diğer taraftan kaynaklanabilir46. Bir transmembran lipid reseptörü (omega-3 yağ asidi dokosaheksaenoik asit için) ve kaveoler transsitozun baskılayıcısı olanMFSD2A, ECs 23,47'nin apikal / luminal alanlarında da bulunur. MFSD2A'nın ifadesi, bu protokol24'te bir örnek olarak gösterildiği gibi, BRB kontrolü üzerindeki etkisine aracılık etmek için Wnt sinyallemesi tarafından transkripsiyonel olarak düzenlenir. Bu nedenle, burada açıklanan teknik, EC tek katmanı tarafından alımı takiben üst / apikal odaya yerleştirilen bir izleyici molekülün tespit edilmesini ve apikal / luminal / kandaki transsitozu bazolateral / abluminal / doku yönüne taklit ederek alt / bazolateral odaya salınmasını içerir. Bu protokol, izleyici molekülleri alt odaya yerleştirerek ve araştırmacıların ihtiyacına uyacak şekilde apikal odaya alım ve salınımı izleyerek transsitozu ters yönde tespit etmek için değiştirilebilir. Ayrıca, gerekirse, endositozlu izleyiciye bağlı hedef molekülün hücre içi birikimini / bozulmasını belirlemek için ek bir adım, sitosol32'de kalan transsitotik veziküllerin daha fazla ölçülmesini sağlayacaktır.

Açıklanan tahlilin birçok avantajı vardır ve BRB / BBB ile ilgili çalışmalarda önemli bir araç olarak hizmet eder, ancak birkaç sınırlama vardır. Perisitler ve glial hücreler gibi iBRB'nin diğer hücre tiplerinden etkileşimlerden yoksun izole bir sistemdir ve bu nedenle fizyolojik in-vivo ortamı tam olarak taklit edemez. TEER değerleri, sıcaklıktaki bir değişiklik veya elektrotların konumlandırılması nedeniyle ölçümler arasında değişebilir25,38. Bununla birlikte, ölçümlerden önce hücrelerin 37 ° C'den oda sıcaklığına dengelenmesi, elektrotların dikkatli bir şekilde kullanılması ve boş kontrollerin dahil edilmesi, dalgalanmanın en aza indirilmesine yardımcı olabilir. Ek olarak, yeterli yıkama ile bile, parasellüler yoldan sızıntı, eser miktarda olsa da, tamamen göz ardı edilemez. HRP transportunun farklı transsitoz yolları arasında, örneğin her ikisi de klatrinden bağımsız olan kavoler transport ve makropinositoz arasında örtüşmesi de meydana gelebilir. Gerektiğinde, ayrım spesifik modülatörler ve / veya kaveola ve mikropinositoz inhibitörleri kullanılarak daha fazla araştırılabilir.

Özetle, bu yazıda BRB/BBB genelinde kaveola veya taşıyıcı aracılı transsitozun nicelleştirilmesine izin veren bir in vitro transsitoz testi anlatılmaktadır. İn vitro tahlil, BRB / BBB kontrolü ile ilgili çeşitli pro-/ anti-anjiyojenik moleküller31, sinyal yolu modülatörleri24 veya ilaç dağıtım sistemleri 27,48'in taranmasında büyük yardımcı olabilir. EC polaritesinin ve yönlü transsitozun araştırılması da bu kullanımı kolay sistemden yararlanabilir. iBRB ve oküler araştırmalar için in vitro modellerin sınırlı mevcudiyeti göz önüne alındığında, burada özetlenen prosedür, perisitler, astrositler ve 3-D organotipik kültürler49 ile birlikte bir ko-kültür sistemi olarak da değiştirilebilir veya hücresel etkileşimleri daha fazla araştırmak ve fizyolojik koşulları in vivo olarak daha iyi taklit etmek için mikrofizyolojik nörovasküler sistemler50 gibi gelişmiş hücre tabanlı modeller kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklanacak çıkar çatışmaları veya finansal çıkarları yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma, JC'ye NIH hibeleri (R01 EY028100, EY024963 ve EY031765) ile desteklenmiştir. ZW, Knights Templar Eye Foundation Kariyer Başlangıç Bursu tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological Safety Cabinet  Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 1286
Cell culture petridish  Nest Biotechnology 704001
Centrifuge  Eppendorf 5702
Centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc. 352097
Centrifuge tubes (50 mL) Denville Scientific Inc. C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin  Jackson ImmunoResearch AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza Bioscience CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements Lonza Bioscience CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) Millipore MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS) Lonza Bioscience CC-4102B
Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Hemocytometer (2-chip) Bulldog Bio DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) Cell Systems ACBRI 181
Incubator Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 3110
L cells (for Control-conditioned medium) ATCC CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) ATCC CRL-2647
Light microscope Leica DMi1
Multimode Plate Reader EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) GIBCO 10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit Thermo Fisher Scientific 15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin) R&D Systems 3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) R&D Systems 293-VE
Syringe filter (0.22 µm) Millipore SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) Corning Inc. CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) GIBCO 25-200-072
Water bath Precision, Thermo Fisher Scientific 51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) Selleckchem S1180

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
  2. Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
  3. Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
  4. Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
  5. Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877 (2021).
  6. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211 (2019).
  7. Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
  8. Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
  9. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  10. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  11. Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
  12. Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
  13. Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , Wiley. Hoboken, NJ. 75-107 (2006).
  14. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
  15. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, Pt 4 440-446 (1991).
  16. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
  17. Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903 (2021).
  18. Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
  19. Honeycutt, S. E., O'Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
  20. Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154 (2020).
  21. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  22. Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
  23. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  24. Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
  25. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  26. Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
  27. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
  28. Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
  29. Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
  30. Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
  31. Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188 (2020).
  32. Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
  33. Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953 (2017).
  34. Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
  35. Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
  36. Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
  37. Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
  38. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
  39. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  40. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  41. Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
  42. Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
  43. Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
  44. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  45. Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
  46. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
  47. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  48. Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019 (2018).
  49. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  50. Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148 (2022).

Tags

Tıp Sayı 184 Kan-retina bariyeri kaveola endotel hücreleri transsitoz Wnt
İç Kan-Retinal Bariyer Geçirgenliğini Değerlendirmek için <em>In Vitro</em> Model Olarak Endotel Hücre Transsitozu Testi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F.,… More

Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F., Maurya, M., Blomfield, A. K., Tomita, Y., Chen, J. Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability. J. Vis. Exp. (184), e64076, doi:10.3791/64076 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter