Denne protokollen illustrerer en in vitro endotelcelletranscytoseanalyse som en modell for å evaluere indre blod-retinal barrierepermeabilitet ved å måle evnen til humane retinale mikrovaskulære endotelceller til å transportere pepperrotperoksidase over celler i caveolae-medierte transcellulære transportprosesser.
Dysfunksjon av blod-retinal barrieren (BRB) bidrar til patofysiologien til flere vaskulære øyesykdommer, noe som ofte resulterer i retinal ødem og påfølgende synstap. Den indre blod-retinale barrieren (iBRB) består hovedsakelig av retinal vaskulært endotel med lav permeabilitet under fysiologiske forhold. Denne egenskapen med lav permeabilitet er tett regulert og opprettholdt av lave paracellulære transporthastigheter mellom tilstøtende retinale mikrovaskulære endotelceller, samt transcellulær transport (transcytose) gjennom dem. Vurderingen av retinal transcellulær barrierepermeabilitet kan gi grunnleggende innsikt i iBRB-integritet i helse og sykdom. I denne studien beskriver vi en endotelcelle (EC) transcytoseanalyse, som en in vitro-modell for evaluering av iBRB-permeabilitet, ved bruk av humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMECs). Denne analysen vurderer HRMECs evne til å transportere transferrin og pepperrotperoksidase (HRP) i henholdsvis reseptor- og caveolaemedierte transcellulære transportprosesser. Fullt konfluerte HRMEC dyrket på porøs membran ble inkubert med fluorescerende merket transferrin (clathrin-avhengig transcytose) eller HRP (caveolae-mediert transcytose) for å måle nivåene av transferrin eller HRP overført til bunnkammeret, noe som indikerer transcytosenivåer over EC-monolaget. Wnt-signalering, en kjent vei som regulerer iBRB, ble modulert for å demonstrere caveolae-mediert HRP-basert transcytoseanalysemetode. EC-transcytoseanalysen beskrevet her kan gi et nyttig verktøy for å undersøke molekylære regulatorer av EC-permeabilitet og iBRB-integritet i vaskulære patologier og for screening av legemiddelleveringssystemer.
Den menneskelige netthinnen er et av de høyeste energikrevende vevene i kroppen. Riktig funksjon av nevrale retina krever en effektiv tilførsel av oksygen og næringsstoffer sammen med en begrenset fluks av andre potensielt skadelige molekyler for å beskytte retinalmiljøet, som er formidlet via blod-retinal barrieren (BRB)1. I likhet med blod-hjernebarrieren (BBB) i sentralnervesystemet, virker BRB som en selektiv barriere i øyet, som regulerer bevegelsen av ioner, vann, aminosyrer og sukker inn og ut av netthinnen. BRB opprettholder også retinal homeostase og dets immunprivilegier ved å forhindre eksponering for sirkulasjonsfaktorer som immunceller, antistoffer og skadelige patogener2. BRB-dysfunksjon bidrar til patofysiologien til flere vaskulære øyesykdommer, som diabetisk retinopati, aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), retinopati av prematuritet (ROP), retinal veneokklusjon og uveitt, noe som resulterer i vasogent ødem og påfølgende synstap 3,4,5.
BRB består av to separate barrierer for henholdsvis to forskjellige okulære vaskulære nettverk: retinal vaskulatur og fenestrert choriocapillaris under netthinnen. Den indre BRB (iBRB) består hovedsakelig av retinale mikrovaskulære endotelceller (RMECs) som fôrer retinal mikrovaskulaturen, som nærer de indre retinale nevronlagene. På den annen side danner retinalpigmentepitelet hovedkomponenten i den ytre BRB, som ligger mellom neurosensorisk retina og choriocapillaris2. For iBRB foregår molekylær transport over RMEC gjennom både paracellulære og transcellulære ruter (figur 1). Den høye graden av substansselektivitet over iBRB er avhengig av (i) tilstedeværelsen av junctional proteinkomplekser som begrenser paracellulær transport mellom tilstøtende endotelceller (ECs), og (ii) lave ekspresjonsnivåer av caveolae mediatorer, transportører og reseptorer i endotelceller som opprettholder lave transcellulære transporthastigheter 1,6,7,8 . Krysskomplekser som regulerer paracellulær fluks består av tette kryss (claudiner, okkludiner), adherenskryss (VE-kadheriner) og gapkryss (connexins), noe som tillater passasje av vann og små vannløselige forbindelser. Mens små lipofile molekyler passivt diffunderer over det indre av RMEC, reguleres bevegelsen av større lipofile og hydrofile molekyler av ATP-drevne transendotelveier, inkludert vesikulær transport og membrantransportører 5,9.
Vesikulær transcytose kan kategoriseres som caveolinmediert caveolar transcytose, clathrin-avhengig (og reseptormediert) transcytose og clathrin-uavhengig makropinocytose (figur 2). Disse vesikulære transportprosessene involverer vesikler i forskjellige størrelser, med makropinosomer som de største (fra 200-500 nm) og caveolae som de minste (i gjennomsnitt 50-100 nm), mens clathrin-belagte vesikler varierer fra 70-150 nm10. Caveolae er kolbeformede lipidrike plasmamembraninvaginasjoner med et proteinbelegg, hovedsakelig sammensatt av caveolin-1 som binder lipidmembrankolesterol og andre strukturelle og signalproteiner via deres caveolin-stillasdomene11. Caveloliner arbeider sammen med perifert festet cavin for å fremme caveolae stabilisering ved plasmamembranen12. Caveolære membraner kan også bære reseptorer for andre molekyler som insulin, albumin og sirkulerende lipoproteiner, inkludert HDL (high density lipoprotein) og low-density lipoprotein (LDL) for å hjelpe bevegelsen over endotelceller13. Under utviklingen avhenger dannelsen av funksjonell BRB av undertrykkelsen av EC-transcytose8. Eldre retinal endotel har derfor relativt lave nivåer av caveolae-, caveolin-1- og albuminreseptorer med hensyn til andre endotelceller under fysiologiske forhold, noe som bidrar til barriereegenskapene 4,9.
Fordi iBRB-nedbrytning er et viktig kjennetegn ved mange patologiske øyeforhold, er det viktig å utvikle metoder for å vurdere retinal vaskulær permeabilitet in vivo og in vitro. Disse metodene bidrar til å gi sannsynlig innsikt i mekanismene for kompromittert BRB-integritet og vurdere effekten av potensielle terapeutiske mål. Nåværende in vivo-avbildning eller kvantitative vaskulære lekkasjeanalyser bruker vanligvis fluorescerende (natriumfluorescein og dextran), kolorimetrisk (Evans Blue dye og pepperrotperoksidase [HRP] substrat) eller radioaktive sporstoffer14 for å oppdage ekstravasering fra vaskulaturen til omkringliggende retinale vev med mikroskopavbildning eller i isolert vevslysat. En ideell tracer for kvantifisering av vaskulær integritet bør være inert og stor nok til fritt å gjennomsyre kompromitterte kar mens den er begrenset i sunne og intakte kapillærer. Metoder som benytter natriumfluorescein eller fluoresceinisotiocyanat-konjugert dekstran (FITC-dextran) i levende fundus fluorescein angiografi (FFA) eller isolerte retinal flate fester er mye brukt for kvantifisering av retinal ekstravasasjon in vivo eller ex vivo. FITC-dextran har fordelen av å være tilgjengelig i forskjellige molekylvekter fra 4-70 kDa for størrelsesselektive studier15,16,17. FITC-albumin (~68 kDa) er et alternativt stort proteinsporstoff av biologisk relevans for vaskulære lekkasjestudier18. Evans Blue dye, injisert intrakardialt19, retro-orbitalt, eller gjennom halevenen 20, er også avhengig av bindingen med endogent albumin for å danne et stort molekyl som kan kvantifiseres ved for det meste spektrofotometrisk deteksjon eller, mindre vanlig, fluorescensmikroskopi i flate monteringer20,21. Disse kvantitative eller lette avbildningsmetodene skiller imidlertid ofte ikke paracellulær transport fra transendoteltransport. For den spesifikke analysen av transcytose med ultrastrukturell visualisering av transcytoserte vesikler, brukes spormolekyler som HRP vanligvis til å lokalisere transcytoserte vesikler i endotelceller som kan observeres under et elektronmikroskop22,23,24 (figur 3A-C).
Utviklingen og bruken av in vitro iBRB-modeller for å evaluere endotelcellepermeabiliteten kan gi robust og høy gjennomstrømningsvurdering for å utfylle in vivo-eksperimenter og hjelpe undersøkelsen av molekylære regulatorer av vaskulær lekkasje. Vanlige analyser for å vurdere paracellulær transport og integritet av tette kryss inkluderer trans-endotelial elektrisk motstand (TEER), et mål på ionisk konduktans (figur 4) 2,25, og in vitro vaskulær lekkasjeanalyse ved bruk av fluorescerende sporstoffer med liten molekylvekt26. I tillegg har transferrinbasert transcytoseanalyse modellering BBB blitt brukt til å utforske clathrin-avhengig transcytose27. Til tross for dette er analyser for å evaluere BRB og mer spesifikt retinal EC caveolar transcytose in vitro begrenset.
I denne studien beskriver vi en EC-transcytoseanalyse ved bruk av humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMECs) som en in vitro-modell for å bestemme iBRB-permeabilitet og EC-transcytose. Denne analysen er avhengig av HRMECs evne til å transportere transferrin eller HRP via henholdsvis reseptormedierte eller caveolae-avhengige transcytoseveier (figur 2). HRMEC dyrket til full konfluens i apikalkammeret (dvs. filterinnsats) ble inkubert med fluorescerende konjugert transferrin (Cy3-Tf) eller HRP for å måle fluorescensintensiteten tilsvarende nivåene av transferrin eller HRP overført til bunnkammeret gjennom EC-transcytose alene. Sammenløp av cellemonolaget kan bekreftes ved å måle TEER, noe som indikerer den tette kryssintegriteten25. For å demonstrere TEER- og transcytoseanalyseteknikken ble kjente molekylære modulatorer av vaskulær permeabilitet og EC-transcytose brukt, inkludert vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF)28 og de i Wnt-signalering (Wnt-ligander: Wnt3a og Norrin)29.
BRB spiller en viktig rolle i retinal helse og sykdom. In vitro-teknikker som vurderer vaskulær permeabilitet har vist seg å være avgjørende verktøy i studier om utvikling og funksjon av barriere (BRB/BBB). Prosedyren beskrevet her kan brukes til å studere de molekylære mekanismene som ligger til grunn for EC-transcytose eller evaluere relaterte molekylære modulatorer som påvirker BRB-permeabilitet. In vitro EC-transcytoseanalyser har flere fordeler i forhold til in vivo-analyser eller…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd (R01 EY028100, EY024963 og EY031765) til JC. ZW ble støttet av en Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.
Biological Safety Cabinet | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 1286 | |
Cell culture petridish | Nest Biotechnology | 704001 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
Centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc. | 352097 | |
Centrifuge tubes (50 mL) | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
Cyanine 3-human Transferrin | Jackson ImmunoResearch | AB_2337082 | |
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza Bioscience | CC-3156 | |
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements | Lonza Bioscience | CC-4176 | |
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) | Millipore | MERS00002 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Lonza Bioscience | CC-4102B | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Hemocytometer (2-chip) | Bulldog Bio | DHC-N002 | |
Horseradish Peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8250 | |
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) | Cell Systems | ACBRI 181 | |
Incubator | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 3110 | |
L cells (for Control-conditioned medium) | ATCC | CRL-2648 | |
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 | |
Light microscope | Leica | DMi1 | |
Multimode Plate Reader | EnSight, PerkinElmer | ||
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) | GIBCO | 10010-023 | |
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit | Thermo Fisher Scientific | 15169 | |
Recombinant human Norrin (rhNorrin) | R&D Systems | 3014-NR | |
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) | R&D Systems | 293-VE | |
Syringe filter (0.22 µm) | Millipore | SLGP033RS | |
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) | Corning Inc. | CLS3470-48EA | |
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) | GIBCO | 25-200-072 | |
Water bath | Precision, Thermo Fisher Scientific | 51221060 | |
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) | Selleckchem | S1180 |