Detta protokoll illustrerar en in vitro-endotelcellstranscytosanalys som en modell för att utvärdera inre blod-retinal barriärpermeabilitet genom att mäta förmågan hos humana retinala mikrovaskulära endotelceller att transportera pepparrotsperoxidas över celler i caveolae-medierade transcellulära transportprocesser.
Dysfunktion i blod-retinal barriären (BRB) bidrar till patofysiologin hos flera vaskulära ögonsjukdomar, vilket ofta resulterar i retinalt ödem och efterföljande synförlust. Den inre blod-retinala barriären (iBRB) består huvudsakligen av retinalt vaskulärt endotel med låg permeabilitet under fysiologiska förhållanden. Denna egenskap av låg permeabilitet regleras tätt och upprätthålls av låga hastigheter av paracellulär transport mellan intilliggande retinala mikrovaskulära endotelceller, såväl som transcellulär transport (transcytos) genom dem. Bedömningen av retinal transcellulär barriärpermeabilitet kan ge grundläggande insikter om iBRB-integritet i hälsa och sjukdom. I denna studie beskriver vi en endotelcell (EC) transcytosanalys, som en in vitro-modell för utvärdering av iBRB-permeabilitet, med hjälp av humana retinala mikrovaskulära endotelceller (HRMECs). Denna analys bedömer HRMECs förmåga att transportera transferrin och pepparrotsperoxidas (HRP) i receptor- respektive caveolae-medierade transcellulära transportprocesser. Helt sammanflytande HRMECs odlade på poröst membran inkuberades med fluorescerande märkt transferrin (clathrinberoende transcytos) eller HRP (caveolae-medierad transcytos) för att mäta nivåerna av transferrin eller HRP som överfördes till den nedre kammaren, vilket indikerar transcytosnivåer över EC-monoskiktet. Wnt-signalering, en känd väg som reglerar iBRB, modulerades för att demonstrera den caveolae-medierade HRP-baserade transcytosanalysmetoden. EC-transcytosanalysen som beskrivs här kan ge ett användbart verktyg för att undersöka de molekylära regulatorerna för EC-permeabilitet och iBRB-integritet i vaskulära patologier och för screening av läkemedelsleveranssystem.
Den mänskliga näthinnan är en av de högsta energikrävande vävnaderna i kroppen. Korrekt funktion av den neurala näthinnan kräver en effektiv tillförsel av syre och näringsämnen tillsammans med ett begränsat flöde av andra potentiellt skadliga molekyler för att skydda näthinnemiljön, som förmedlas via blod-retinal barriären (BRB)1. I likhet med blod-hjärnbarriären (BBB) i centrala nervsystemet fungerar BRB som en selektiv barriär i ögat och reglerar rörelsen av joner, vatten, aminosyror och socker in och ut ur näthinnan. BRB upprätthåller också retinal homeostas och dess immunprivilegium genom att förhindra exponering för cirkulationsfaktorer såsom immunceller, antikroppar och skadliga patogener2. BRB-dysfunktion bidrar till patofysiologin hos flera vaskulära ögonsjukdomar, såsom diabetisk retinopati, åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), retinopati av prematuritet (ROP), retinal venocklusion och uveit, vilket resulterar i vasogent ödem och efterföljande synförlust 3,4,5.
BRB består av två separata barriärer för två distinkta okulära vaskulära nätverk: retinal vaskulatur och fenestrated choriocapillaris under näthinnan. Den inre BRB (iBRB) består huvudsakligen av retinala mikrovaskulära endotelceller (RMEC) som kantar retinal mikrovaskulatur, som ger näring åt de inre retinala neuronala skikten. Å andra sidan utgör retinalpigmentepitelet huvudkomponenten i den yttre BRB, som ligger mellan den neurosensoriska näthinnan och choriocapillaris2. För iBRB sker molekylär transport över RMEC genom både paracellulära och transcellulära vägar (figur 1). Den höga graden av substansselektivitet över iBRB är beroende av (i) närvaron av korsningsproteinkomplex som begränsar paracellulär transport mellan intilliggande endotelceller (ECs) och (ii) låga uttrycksnivåer av caveolae-mediatorer, transportörer och receptorer inom endotelcellerna som upprätthåller låga hastigheter av transcellulär transport 1,6,7,8 . Korsningskomplex som reglerar paracellulärt flöde består av täta korsningar (claudiner, ockludiner), vidhäftande korsningar (VE-kadheriner) och gapkorsningar (connexiner), vilket möjliggör passage av vatten och små vattenlösliga föreningar. Medan små lipofila molekyler passivt diffunderar över det inre av RMEC, regleras rörelsen av större lipofila och hydrofila molekyler av ATP-drivna transendoteliala vägar inklusive vesikulär transport och membrantransportörer 5,9.
Vesikulär transcytos kan kategoriseras som caveolinmedierad caveolär transcytos, clathrinberoende (och receptormedierad) transcytos och clathrinoberoende makropinocytos (Figur 2). Dessa vesikulära transportprocesser involverar vesiklar av olika storlek, där makropinosomer är de största (från 200-500 nm) och caveolae är de minsta (i genomsnitt 50-100 nm), medan clathrinbelagda vesiklar sträcker sig från 70-150 nm10. Caveolae är kolvformade lipidrika plasmamembraninvaginationer med en proteinbeläggning, främst bestående av caveolin-1 som binder lipidmembrankolesterol och andra strukturella och signalerande proteiner via deras caveolin-byggnadsställningsdomän11. Caveoliner arbetar tillsammans med perifert fäst cavin för att främja caveolae-stabilisering vid plasmamembranet12. Caveolar membran kan också bära receptorer för andra molekyler såsom insulin, albumin, och cirkulerande lipoproteiner inklusive high-density lipoprotein (HDL) och low-density lipoprotein (LDL) för att hjälpa deras rörelse över endotelceller13. Under utvecklingen beror bildandet av funktionell BRB på undertryckandet av EC-transcytos8. Äldre retinalt endotel har därför relativt låga nivåer av caveolae-, caveolin-1- och albuminreceptorer med avseende på andra endotelceller under fysiologiska förhållanden, vilket bidrar till dess barriäregenskaper 4,9.
Eftersom iBRB-nedbrytning är ett viktigt kännetecken för många patologiska ögonsjukdomar är det viktigt att utveckla metoder för att bedöma retinal vaskulär permeabilitet in vivo och in vitro. Dessa metoder hjälper till att ge sannolika insikter i mekanismerna för komprometterad BRB-integritet och bedöma effekten av potentiella terapeutiska mål. Nuvarande in vivo-avbildning eller kvantitativa vaskulära läckageanalyser använder vanligtvis fluorescerande (natriumfluorescein och dextran), kolorimetriskt (Evans Blue-färgämne och pepparrotsperoxidas [HRP] substrat) eller radioaktiva spårämnen14 för att detektera extravasering från vaskulaturen till omgivande näthinnevävnader med mikroskopavbildning eller i isolerat vävnadslysat. Ett idealiskt spårämne för kvantifiering av vaskulär integritet bör vara inert och tillräckligt stort för att fritt tränga igenom komprometterade kärl medan det är inneslutet i friska och intakta kapillärer. Metoder som använder natriumfluorescein eller fluoresceinisotiocyanatkonjugerad dextran (FITC-dextran) i levande fundus fluoresceinangiografi (FFA) eller isolerade retinala platta fästen används ofta för kvantifiering av retinal extravasation in vivo eller ex vivo. FITC-dextran har fördelen att det finns i olika molekylvikter från 4-70 kDa för storlekselektiva studier15,16,17. FITC-albumin (~68 kDa) är ett alternativt storskaligt proteinspårare av biologisk relevans för kärlläckagestudier18. Evans Blue-färgämne, injicerat intrakardiellt19, retro-orbitalt eller genom svansvenen 20, förlitar sig också på dess bindning med endogent albumin för att bilda en stor molekyl som kan kvantifieras genom mestadels spektrofotometrisk detektion eller, mindre vanligt, fluorescensmikroskopi i platta fästen20,21. Dessa kvantitativa eller lätta avbildningsmetoder skiljer emellertid ofta inte paracellulär transport från transendoteltransport. För den specifika analysen av transcytos med ultrastrukturell visualisering av transcytoserade vesiklar används spårmolekyler såsom HRP vanligtvis för att lokalisera transcytoserade vesiklar i endotelceller som kan observeras under ett elektronmikroskop22,23,24 (Figur 3A-C).
Utvecklingen och användningen av in vitro iBRB-modeller för att utvärdera endotelcellpermeabiliteten kan ge robust och hög genomströmningsbedömning för att komplettera in vivo-experiment och hjälpa till att undersöka molekylära regulatorer för vaskulärt läckage. Vanliga analyser för att bedöma paracellulär transport och integritet hos täta korsningar inkluderar transendotelial elektrisk resistans (TEER), ett mått på jonisk konduktans (figur 4)2,25 och in vitro-vaskulär läckageanalys med hjälp av fluorescerande spårämnenmed liten molekylvikt 26. Dessutom har transferrinbaserade transcytosanalyser som modellerar BBB använts för att utforska clathrinberoende transcytos27. Trots detta är analyser för att utvärdera BRB och, mer specifikt, retinal EC caveolar transcytos in vitro begränsade.
I denna studie beskriver vi en EC-transcytosanalys med humana retinala mikrovaskulära endotelceller (HRMECs) som en in vitro-modell för att bestämma iBRB-permeabilitet och EC-transcytos. Denna analys är beroende av HRMECs förmåga att transportera transferrin eller HRP via de receptormedierade respektive caveolae-beroende transcytosvägarna (figur 2). HRMECs odlade till full sammanflöde i den apikala kammaren (dvs. filterinsats) inkuberades med fluorescerande konjugerat transferrin (Cy3-Tf) eller HRP för att mäta fluorescensintensiteten som motsvarar nivåerna av transferrin eller HRP som överfördes till bottenkammaren genom enbart EC-transcytos. Sammanflödet av cellmonolagret kan bekräftas genom att mäta TEER, vilket indikerar den snäva korsningsintegriteten25. För att demonstrera TEER- och transcytosanalystekniken användes kända molekylära modulatorer av vaskulär permeabilitet och EC-transcytos, inklusive vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF)28 och de i Wnt-signalering (Wnt-ligander: Wnt3a och Norrin)29.
BRB spelar en viktig roll i retinal hälsa och sjukdom. In vitro-tekniker som bedömer vaskulär permeabilitet har visat sig vara avgörande verktyg i studier om barriärutveckling (BRB/BBB) och funktion. Förfarandet som beskrivs här kan användas för att studera de molekylära mekanismerna som ligger till grund för EC-transcytos eller utvärdera relaterade molekylära modulatorer som påverkar BRB-permeabiliteten. In vitro EC-transcytosanalyser har flera fördelar jämfört med in vivo-analyser…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag (R01 EY028100, EY024963 och EY031765) till JC. ZW stöddes av ett Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.
Biological Safety Cabinet | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 1286 | |
Cell culture petridish | Nest Biotechnology | 704001 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
Centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc. | 352097 | |
Centrifuge tubes (50 mL) | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
Cyanine 3-human Transferrin | Jackson ImmunoResearch | AB_2337082 | |
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza Bioscience | CC-3156 | |
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements | Lonza Bioscience | CC-4176 | |
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) | Millipore | MERS00002 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Lonza Bioscience | CC-4102B | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Hemocytometer (2-chip) | Bulldog Bio | DHC-N002 | |
Horseradish Peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8250 | |
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) | Cell Systems | ACBRI 181 | |
Incubator | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 3110 | |
L cells (for Control-conditioned medium) | ATCC | CRL-2648 | |
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 | |
Light microscope | Leica | DMi1 | |
Multimode Plate Reader | EnSight, PerkinElmer | ||
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) | GIBCO | 10010-023 | |
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit | Thermo Fisher Scientific | 15169 | |
Recombinant human Norrin (rhNorrin) | R&D Systems | 3014-NR | |
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) | R&D Systems | 293-VE | |
Syringe filter (0.22 µm) | Millipore | SLGP033RS | |
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) | Corning Inc. | CLS3470-48EA | |
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) | GIBCO | 25-200-072 | |
Water bath | Precision, Thermo Fisher Scientific | 51221060 | |
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) | Selleckchem | S1180 |