Summary
Los esferoides tumorales se utilizan cada vez más para evaluar las interacciones entre células tumorales y microambientes y la respuesta a la terapia. El presente protocolo describe un método robusto pero simple para imágenes de semi-alto rendimiento de esferoides tumorales 3D utilizando una limpieza óptica rápida.
Abstract
Los esferoides tumorales se están convirtiendo rápidamente en algo común en la investigación básica del cáncer y el desarrollo de fármacos. La obtención de datos sobre la expresión de proteínas dentro del esferoide a nivel celular es importante para el análisis, sin embargo, las técnicas existentes a menudo son costosas, laboriosas, utilizan equipos no estándar, causan una distorsión significativa del tamaño o se limitan a esferoides relativamente pequeños. Este protocolo presenta un nuevo método de montaje y limpieza de esferoides que aborda estos problemas al tiempo que permite el análisis confocal de la estructura interna de los esferoides. A diferencia de los enfoques existentes, este protocolo prevé el montaje y la limpieza rápidos de un gran número de esferoides utilizando equipos estándar y suministros de laboratorio. El montaje de esferoides en una solución de gel de agarosa-PBS de pH neutro antes de introducir una solución de limpieza con índice de refracción minimiza la distorsión del tamaño común a otras técnicas similares. Esto permite un análisis cuantitativo y estadístico detallado donde la precisión de las mediciones de tamaño es primordial. Además, en comparación con las soluciones de limpieza líquida, la técnica de gel de agarosa mantiene los esferoides fijos en su lugar, lo que permite la recopilación de imágenes confocales tridimensionales (3D). El presente artículo explica cómo el método produce imágenes de alta calidad en dos y 3D que proporcionan información sobre la variabilidad intercelular y la estructura esferoide interna.
Introduction
Los cultivos celulares tridimensionales (3D), como los esferoides, proporcionan modelos biológicamente realistas y reproducibles del crecimiento celular agregado 1,2. Estos modelos se están convirtiendo rápidamente en algo común tanto en la investigación básica como en el desarrollo de fármacos, donde se examinan las diferencias en el tamaño y la estructura de los esferoides entre los tratamientos para determinar la eficacia del fármaco 3,4. En estos contextos, la capacidad de recopilar información detallada de un gran número de esferoides es altamente ventajosa, tanto desde una perspectiva de poder estadístico como para permitir una evaluación rápida del comportamiento celular en varios tratamientos.
Las técnicas comúnmente utilizadas para obtener imágenes de microscopía detalladas de la estructura esferoide consumen mucho tiempo, son costosas o producen imágenes de baja calidad que no conservan características cuantitativas clave, como el tamaño del esferoide 4,5. Por ejemplo, las técnicas histológicas basadas en la crioseccionamiento pueden proporcionar imágenes de alta calidad, pero a menudo consumen mucho tiempo, requieren mano de obra calificada y, a menudo, crean artefactos de seccionamiento 6,7, mientras que las tecnologías elegantes, como la microscopía de iluminación de un solo plano (SPIM)8 y la microscopía multifotónica9 requieren microscopios especializados que no están fácilmente disponibles. Las tecnologías modernas de microscopía han permitido recientemente la llamada seccionamiento óptico, donde los esferoides se colocan dentro de una solución de limpieza de índice de refracción coincidente y las imágenes se obtienen utilizando microscopía confocal 4,5. Si bien estas técnicas tienen el potencial de producir un alto rendimiento, los problemas comunes incluyen el movimiento de los esferoides durante la toma de imágenes, la distorsión del tamaño durante la limpieza y el alto gasto de las soluciones de limpieza patentadas. Además, muchos protocolos existentes se aplican solo a esferoides relativamente pequeños de menos de 300 μm de diámetro o profundidad de hasta 100 μm, lo que limita la tecnología a las primeras etapas del crecimiento tumoral 5,10,11.
El presente protocolo permite la recolección de imágenes esferoides detalladas de alto rendimiento y semi-alto rendimiento utilizando una solución de limpieza de índice de refracción de bajo costo derivada de procedimientos de limpieza de órganos completos12,13. Para evitar el movimiento de los esferoides durante la toma de imágenes y proporcionar soporte estructural para reducir la distorsión del tamaño, los esferoides se montan en gel de agarosa-PBS en una placa de fondo de vidrio # 1.5 de 24 pocillos. Dado que esta técnica permite montar múltiples esferoides en cada pozo en una placa de 24 pocillos, se pueden montar rápidamente hasta 360 esferoides (15 esferoides / pozo) y obtener imágenes rápidamente en diversas condiciones experimentales. Se utiliza una solución de limpieza con índice de refracción construido a partir de consumibles fácilmente disponibles para limpiar ópticamente los esferoides montados y el gel circundante. Después de un período de asentamiento de 24 h, este protocolo proporciona imágenes 2D y 3D de alta calidad de la estructura esferoide, incluso para esferoides relativamente grandes (aproximadamente 700 μm de diámetro), con menos del 2% de distorsión de tamaño.
Protocol
El protocolo describe la preparación de una cantidad suficiente de esferoides tumorales para montar una placa de 24 pocillos (aproximadamente 240-360 esferoides o 10-15 esferoides/pozo) a 200 μL de gel de agarosa por pozo y 500 μL de solución de limpieza por pozo. El procedimiento completo se ilustra en la Figura 1.
1. Preparación de gel de agarosa-PBS al 2%
- Pesar 0,5 g de agarosa de baja fusión (ver Tabla de Materiales) en una botella de vidrio y añadir 25 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Derretir la agarosa hirviendo la solución en un microondas durante 30-60 s con la tapa cerrada pero no sellada y con remolino constante. Asegúrese de que la agarosa esté completamente disuelta y que la solución no hierva.
NOTA: El gel se puede almacenar a temperatura ambiente; compruebe el volumen antes de usarlo para tener en cuenta la evaporación. Llevar al estado líquido (microondas; 20-60 s con remolino) antes de usar.
2. Preparación de la solución de compensación
- Pesar 9 g de N,N,N′,N′-Tetrakis(2-hidroxipropil) etilendiamina, 22 g de urea, 44 g de sacarosa, 0,1 g de Tritón X-100 y 24,9 g de agua desionizada (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Es más fácil pesar la cantidad aproximada de N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hidroxipropil)etilendiamina y ajustar el peso de otros componentes para obtener la concentración deseada. - Calentar la solución en un baño de agua a 56 °C con una mezcla constante y continuar hasta que todos los cristales se disuelvan.
- Coloque la solución a temperatura ambiente para permitir que las burbujas formadas durante la mezcla suban a la superficie. La solución es estable a temperatura ambiente durante un máximo de 2 meses.
3. Preparación de esferoides
- Generar esferoides utilizando el método de superposición de agarosa como se describió anteriormente 1,3,14.
NOTA: Los esferoides generados por otros métodos también son compatibles con este protocolo de imágenes. - Corte la punta de una punta de pipeta de 1 ml con un bisturí para agrandar el orificio.
NOTA: Todos los esferoides se manejaron con pipetas de 1 ml o 200 μL con puntas cortadas. - Usando la pipeta, aspire los esferoides de los pozos y transfiéralos a un tubo cónico transparente de 1,5 ml. Se pueden combinar múltiples esferoides de las mismas condiciones en el mismo tubo.
NOTA: Siempre permita que los esferoides se asienten en la parte inferior del tubo para aspirar el medio. - Lave los esferoides en 1 ml de PBS dos veces, agregue una solución neutra de paraformaldehído precalentado al 4% (PFA) e incube los esferoides a 37 ° C durante 20 min.
- Retire la solución de PFA y lave los esferoides dos veces con 1 ml de PBS.
4. Tinción esferoide
- Usando una pipeta, transfiera hasta 15 esferoides a un tubo pcr de 200 μL.
NOTA: Para los esferoides frágiles, monte los esferoides en gel (pasos 5.1-5.4) antes de continuar. - Permeabilizar las células utilizando 200 μL de Tritón X-100 al 0,5% en PBS. Coloque los tubos de PCR dentro de tubos de tapón de rosca de 50 ml e incube los esferoides durante 2 h a temperatura ambiente con agitación suave.
NOTA: Todas las incubaciones se realizan con agitación en un rotor, rodillo o agitador (consulte la Tabla de materiales) a menos que se especifique lo contrario. Esto es importante para lograr una tinción uniforme. Los esferoides fijos en PBS a veces pueden adherirse a los lados de la punta de la pipeta. Enjuagar la punta en Tritón X-100 al 0,5% minimiza que los esferoides se peguen a las puntas. - Reemplace la solución (paso 4.2) con 200 μL de tampón de dilución de anticuerpos (ABDIL)15 e incube durante la noche a temperatura ambiente.
- Retire ABDIL, agregue 75 μL de anticuerpo primario en ABDIL e incube a 4 °C durante 2,5 días.
- Retire el sobrenadante y lave con 200 μL de PBS con 0.1% Tween y 0.1% Triton X-100 (PBS-TT) dos veces e incube con 200 μL de PBS-TT durante 4 h a temperatura ambiente.
- Retire PBS-TT, agregue 100 μL de anticuerpo secundario en ABDIL e incube a 4 °C durante 2,5 días.
NOTA: DAPI u otro tinte nuclear se puede agregar en esta etapa. La mayoría de los colorantes requieren menos tiempo de incubación que los anticuerpos. - Retire el sobrenadante y lave con 200 μL de PBS-TT dos veces e incube con 200 μL de PBS-TT durante 4 h. Los esferoides están listos para su montaje.
5. Montaje
- Usando una pipeta de 200 μL, transfiera esferoides fijos y teñidos a tubos de PCR de 500 μL a un tubo por condición (aproximadamente 10-15 esferoides).
- Reemplace la solución con 200 μL de gel de agarosa líquida al 2% (p/v) y centrífuga en el centrifugado rápido (a la velocidad máxima fija, consulte la Tabla de materiales) a temperatura ambiente durante 30 s.
NOTA: A menos que se monte inmediatamente, colóquelo en un bloque calefactor a 50 °C para evitar el endurecimiento del gel. - Aspire los esferoides en ~ 50 μL de gel de agarosa líquida y dispense en el pozo de una placa de fondo de vidrio de 24 pocillos.
- Antes de que el gel se endurezca, separe los esferoides usando una punta de pipeta en el gel circundante y asegúrese de que los esferoides estén cubiertos con gel. Opcionalmente, coloque la placa sobre hielo para fijar rápidamente el gel.
NOTA: El número de esferoides por pozo depende del tamaño de los esferoides. Los esferoides se colocan lejos unos de otros para que solo un esferoide entre en el campo de visión mientras se toman imágenes. Esto es importante para el procesamiento automatizado de imágenes. - Agregue 500 μL de solución de limpieza (paso 2) por pozo, asegurando que el gel esté sumergido. Incubar en RT durante al menos 24 h y obtener una imagen de los esferoides en la solución de limpieza. Los esferoides son estables en esta solución hasta por un mes a temperatura ambiente y cuando están protegidos de la evaporación.
6. Imágenes
- Elija un objetivo con una distancia de trabajo lo suficientemente larga como para abarcar todo el esferoide, incluida la altura de montaje del esferoide en el recipiente.
NOTA: Se requieren objetivos con una distancia de trabajo de 3 mm o más para obtener imágenes del plano ecuatorial de los esferoides. Los objetivos de mayor aumento con un NA más alto pueden permitir una mejor resolución, pero limitarán la profundidad máxima a la que se pueden obtener imágenes de los esferoides. - Para identificar el plano ecuatorial, ajuste el enfoque hasta que se alcance el área de superficie más grande en el plano XY y la imagen con el porcentaje de potencia láser requerido, el voltaje del detector, la ganancia y la configuración de desplazamiento.
NOTA: El porcentaje de potencia del láser, el voltaje del detector, la ganancia y el desplazamiento variarán mucho según el fluoróforo, la intensidad de la tinción, la intensidad del láser, la sensibilidad del detector, etc. - Para imágenes 3D, establezca el inicio y el final de los esferoides y elija la intensidad de señal adecuada a varias profundidades z utilizando los ajustes de corrección de intensidad z antes de obtener imágenes.
NOTA: Para obtener la mejor resolución de imagen, utilice la frecuencia de muestreo de Nyquist para x, y y z (para obtener más información, consulte la referencia16).
Representative Results
Para demostrar la capacidad de este método de limpieza para proporcionar imágenes bidimensionales y tridimensionales de alta calidad, se cultivaron esferoides con diámetros de 300-600 μm a partir de líneascelulares de melanoma transducidas por F luorescent Ubiquitinación C ell Cycle Indicator (FUCCI) FUCCI-WM164 y FUCCI-WM983b 9,17 , que expresan la proteína monomérica Kusabira Orange2 (mKO2) y la proteína monomérica Azami Green (mAG) cuando se encuentran en Gap1, y la fase S temprana / Gap2 / mitosis del ciclo celular, respectivamente de acuerdo con los procedimientos proporcionados en el paso 3 1,3,14. Los esferoides se fijaron con una solución de formaldehído al 4% a 37 °C, permeabilizada y teñida con anti-p27kip1/anti-conejo Alexa Fluor 647 anti-pimonidazol/anti-ratón Alexa Fluor 647, DAPI o DRAQ7 (ver Tabla de Materiales) (Figura 2). Todos los archivos de microscopía se cargan en el repositorio de GitHub (https://github.com/ap-browning/SpheroidMounting). En comparación con los esferoides montados en PBS, la solución de limpieza proporciona imágenes de alta claridad con una distorsión de tamaño mínima (Figura 2A). El protocolo permite obtener imágenes de alta resolución de detalles a nivel celular más profundos en los esferoides sin seccionamiento histológico, y la imagen transversal se obtuvo de un objetivo de aire 20x (0.7 NA) a una resolución de 4096 x 4096 px sin costuras (Figura 2B). Utilizando un objetivo de menor aumento y menor apertura numérica con una distancia de trabajo más larga, se pueden obtener imágenes confocales 3D que proporcionan detalles a nivel celular a una profundidad de al menos 200 μm (Figura 2C). Los esferoides también fueron crioseccionados y teñidos según el protocolo de Spoerri et al.4 y comparados con la tinción esferoide completa (Figura 2D,E). La Figura 2D muestra la región hipóxica del esferoide teñido por pimonidazol, y la Figura 2E muestra la tinción p27kip1 que marca la detención del ciclo celular (amarillo) y la tinción nuclear DAPI (gris). La localización de proteínas y el patrón de tinción son similares entre la criosecciona y la limpieza y, por lo tanto, no se ven afectados por este método de limpieza.
La corrección de la intensidad de la señal en z permite la obtención de imágenes de todo el esferoide. Sin embargo, la dispersión de la luz debido al núcleo necrótico limita la capacidad de obtener imágenes del lado oculto del esferoide. La penetración más profunda y la menor dispersión de un fluoróforo de color rojo lejano, como la tinción nuclear DRAQ7, permiten una representación aún más mejorada de la estructura esferoide 3D (Figura 3). La película 1 muestra la representación 3D de los esferoides FUCCI teñidos con DRAQ7. Una rebanada z más delgada puede permitir una mejor resolución z, pero esto aumenta significativamente el tiempo de imagen y el fotoblanqueo de los fluoróforos.
Para determinar si la solución de limpieza causa distorsión del tamaño, se tomaron imágenes de doce esferoides en gel de agarosa-PBS al 2% a las 6 h, 12 h, 24 h, 72 h y 168 h después de la introducción de la solución de limpieza. Las imágenes se resumieron determinando el diámetro del esferoide, definido en base a una esfera con la misma área de sección transversal que el esferoide (Figura 4A). Mientras que se observa que los esferoides aumentan ligeramente de tamaño durante las primeras 6 h, indicado por un cambio de pliegue de diámetro de entre el 2% y el 6% (Figura 4B), después de 24 h a 72 h, los esferoides vuelven a un tamaño aproximadamente igual al tamaño correspondiente en PBS después de la fijación de PFA (Figura 4C).
Figura 1: Ilustración del protocolo de montaje y limpieza de esferoides. Los esferoides fijos y teñidos se transfieren a un tubo de 500 μL; el exceso de líquido se reemplaza por 200 μL de gel de agarosa-PBS y se centrifuga. Los esferoides se transfieren a un pozo con fondo de vidrio en una placa de 24 pocillos. Después de que se deja que el gel se solidifique, se agrega una solución de limpieza de 500 μL y se permite que los esferoides se equilibren. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Comparación de los esferoides de melanoma humano FUCCI no aclarados y no aclarados. La coloración indica núcleos celulares positivos para mKO2 (rojo), lo que indica células en el espacio 1; y núcleos celulares positivos para mAG (verde), que indica células en brecha 2. (A) Esferoides cultivados a partir de 5000 células FUCCI-WM983b, cosechados en el día 10 y fotografiados en gel de agarosa-PBS y 24 h después de la solución de limpieza se agrega. La comparación de imágenes de campo brillante y confocales antes y después de la solución de limpieza muestra una distorsión de tamaño mínima y una gran ganancia de claridad. Las imágenes se obtienen utilizando un objetivo 10x. (B) Esferoides cultivados a partir de células FUCCI-WM164 permeabilizadas con Triton X-100 y teñidas con DRAQ7, teñiendo todos los núcleos celulares. La imagen se obtiene utilizando un objetivo 20x (0.75 NA), lo que demuestra que la solución de limpieza permite obtener imágenes de alta resolución de detalles a nivel celular. (C) Se obtuvieron imágenes 3D (10x, 0.4 NA) de esferoides FUCCI-WM164 en PBS, y 24 h después de que se agregó la solución de limpieza. El ajuste de la potencia, el voltaje y el desplazamiento del láser en diferentes planos z permite obtener imágenes más profundas dentro del esferoide. (D,E) Comparación entre crioseccion y esferoide entero aclarado teñido para pimonidazol y p27kip1. (D) La tinción de pimonidazol en magenta muestra la región hipóxica en los esferoides. Rojo y verde indican FUCCI. (E) Criosecciones y esferoide despejado que muestran DAPI (gris) y p27kip1 (amarillo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La limpieza permite obtener imágenes más profundas en el esferoide con una pérdida de luz mínima. Imágenes de microscopía confocal de un esferoide de melanoma humano FUCCI a un aumento de 10x y NA más bajo (0.4), lo que permite obtener imágenes a mayor profundidad z con una pérdida de señal mínima. (A) Cortes de 3.88 μm de núcleos esferoides teñidos con DRAQ7. (B-D) resolución y/z en los canales 488 (mAG), 568 (mKO2) y 647 nm (DRAQ7), respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La solución de limpieza tiene un impacto mínimo en el tamaño de los esferoides. (A) Distribución del tamaño inicial del esferoide (diámetro equivalente) en gel PBS (n = 12 esferoides). (B) Cambio de pliegue de diámetro a lo largo del tiempo desde la adición de la solución de limpieza. A las 0 h, los esferoides están solo en gel PBS. (C) Distribución de los cambios de pliegue de diámetro a las 12 h, 24 h y 72 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1: Representación 3D de un esferoide FUCCI teñido con DRAQ7. Haga clic aquí para descargar esta película.
Discussion
Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes bidimensionales y tridimensionales de alta calidad de esferoides tumorales. Los métodos existentes, como CLARITY, See deep brain (SeeDB) y ScaleS, a menudo causan distorsión del tamaño hasta en un 30%, mientras que técnicas como el alcohol bencílico / benzoato de bencilo (BABB) y las imágenes 3D de órganos eliminados con solventes (3DISCO) pueden apagar la proteína fluorescente18. Muchos de estos métodos están diseñados para limpiar el tejido con integridad estructural y distorsionar el tamaño y la estructura cuando se aplican a los esferoides18. A diferencia de otros protocolos que utilizan soluciones de compensación costosas disponibles comercialmente, este protocolo utiliza consumibles fácilmente disponibles mientras mantiene la claridad óptica y la fluorescencia endógena y minimiza la distorsión del tamaño. La incrustación de esferoides en gel de agarosa-PBS proporciona soporte estructural para los esferoides y minimiza el choque osmótico cuando se agrega la solución de limpieza. Esto es crucial cuando se toman imágenes de esferoides frágiles después del tratamiento farmacológico. Se supone que este método de limpieza óptica es adecuado para esferoides formados por cualquier método, ya que este protocolo está adaptado de la limpieza de tejido entero. La suposición se basa en la similitud en los esferoides obtenidos por diferentes métodos de formación de esferoides. La elección del fijador puede afectar el tamaño de los esferoides, así como la fluorescencia endógena. Este método de limpieza es adecuado para esferoides fijados con solución neutra de PFA al 4%. Se requieren pruebas adicionales para verificar su compatibilidad con otros fijadores.
Dado que esta técnica permite montar múltiples esferoides simultáneamente en una placa de múltiples pocillos, es muy adecuada para tuberías de análisis cuantitativo que requieren información de estructura esferoide de hasta 360 esferoides por placa de 24 pocillos. Los microscopios con funciones automatizadas de mapeo de etapas y placas pueden hacer que las imágenes sean menos manuales. A pesar de que este método es más rápido y fácil que la seccionamiento, actualmente no es adecuado para una automatización completa. Sin embargo, las imágenes obtenidas por este método son adecuadas para el procesamiento automatizado de imágenes 4,19, y la velocidad a la que se pueden montar los esferoides utilizando este protocolo se presta al análisis cuantitativo de la estructura interna de los esferoides 20,21,22.
Para teñir esferoides enteros, la concentración de anticuerpos, el volumen y el tiempo de incubación deben optimizarse para cada anticuerpo. Como guía, use 2.5x de la concentración recomendada de anticuerpos de inmunofluorescencia 2D y 100-200 μL de anticuerpos, dependiendo del número de esferoides por tubo. Asegúrese de que todos los esferoides estén cubiertos de solución de tinción cuando esté en el rotor. El tiempo de incubación depende de muchos factores, incluyendo el tamaño y la densidad de los esferoides y el anticuerpo, y puede variar de 16-72 h. A pesar de que el método permite la detección de señales más profundas dentro del esferoide, los fluoróforos excitados por UV causan una dispersión significativa de la luz, lo que lleva a una baja relación señal-ruido. Se debe tener cuidado al elegir fluoróforos para visualizar la proteína objetivo. Por ejemplo, la tinción de proteínas menos abundantes y estructurales con fluoróforos de longitud de onda más larga y tinciones proteicas o nucleares más abundantes con fluoróforos de longitud de onda más corta logrará el mejor resultado. Finalmente, los esferoides borrados todavía muestran pérdida de luz debido a la dispersión en el núcleo necrótico, evidente en la dimensión y/z de las imágenes obtenidas de esferoides de 600 μm (Figura 2C).
Las imágenes de mayor aumento con objetivos NA más altos son posibles con esferoides montados y despejados utilizando este protocolo, pero la distancia de trabajo del objetivo limita la profundidad de la imagen. Para una lente de inmersión en aceite, es importante utilizar aceite que tenga un RI de 1.51 para obtener el mejor resultado.
Para resumir, el método de limpieza incrustada en gel de agarosa-PBS permite la visualización de las células en el interior de los esferoides utilizando consumibles comúnmente disponibles. Los esferoides montados y limpiados utilizando este método sufren una distorsión de tamaño mínima y mantienen su integridad estructural, lo que permite la recopilación de datos de alta calidad relacionados con la estructura esferoide interna y la posterior cuantificación automatizada.
Disclosures
Olympus contribuyó a los costos de publicación.
Acknowledgments
Esta investigación se llevó a cabo en el Instituto de Investigación Traslacional (TRI), Woolloongabba, QLD. El TRI cuenta con el apoyo de una subvención del Gobierno australiano. Agradecemos al personal de la instalación central de microscopía del TRI su excelente apoyo técnico. Agradecemos al Prof. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japón, por proporcionar las construcciones de FUCCI, al Prof. Meenhard Herlyn y a la Sra. Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, PA, por proporcionar las líneas celulares. Agradecemos a la Dra. Loredana Spoerri por proporcionar imágenes de criosección C8161.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de proyectos a N.K.H.: Australian Research Council (DP200100177) y Meehan Project Grant (021174 2017002565).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass bottom 24-well plate | Celvis | P24-1.5H-N | |
| 500 µL clear PCR tubes | Sigma | HS4422 | |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno research | 715-605-151 | Dilution used 1:500 |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | Final concentration 2% w/v |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | Final concentration 5 µg/mL |
| Deionized water | MILLI Q | ||
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermofisher | A-31573 | Dilution used 1:500 |
| DRAQ7 | Thermofisher | D15106 | Dilution used 1:250 |
| Heating block | Ratek | DBH10 | or similar equipment |
| Hypoxyprobe Kits | Hypoxyprobe | HP1-1000Kit | Antibody dilution used 1:500 |
| Low-melting agarose powder | Sigma | A9414 | Final concentration 2% w/v |
| Microwave | Sharp | ||
| N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma | 122262 | Final concentration 9% w/w |
| NaCl | Sigma | S9888 | Final concentration 150 mM |
| NaN3 | Sigma | S2002 | Final concentration 0.10% w/v |
| p27 Kip1 (D69C12) XP | Cell Signalling technology | 3686S | Dilution used 1:500 |
| Paraformaldehyde solution | Proscitech | C004 | Final concentration 4% w/v |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermofisher | 18912014 | Final concentration 1x |
| Pipette | Eppendorf | ||
| Quickspin minifuge | or similar equipment | ||
| Roller | Ratek | BTR10-12V | or similar equipment |
| Rotor | Ratek | RSM7DC | or similar equipment |
| Shaker | Ratek | EOM5 | or similar equipment |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Final concentration 44% w/w |
| Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T5941 | Final concentration 20 mM |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.10% v/v |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.1% v/v |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | Final concentration 0.1% v/v |
| Urea | Sigma | U5379 | Final concentration 22% w/w |
References
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