이 프로토콜은 인간 혈장에서 성상세포 유래 세포외 소포체(ADEV)의 농축을 설명합니다. 이는 폴리머 침전에 의한 EV의 분리를 기반으로 하며, ADEV의 ACSA-1 기반 면역 캡처를 기반으로 합니다. ADEV의 분석은 액체 생검에 의해 비침습적으로 살아있는 환자의 염증 경로 변화를 연구할 수 있는 단서를 제공할 수 있습니다.
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방법 논문
이 프로토콜은 인간 혈장에서 성상세포 유래 세포외 소포체(ADEV)의 농축을 설명합니다. 이는 폴리머 침전에 의한 EV의 분리를 기반으로 하며, ADEV의 ACSA-1 기반 면역 캡처를 기반으로 합니다. ADEV의 분석은 액체 생검에 의해 비침습적으로 살아있는 환자의 염증 경로 변화를 연구할 수 있는 단서를 제공할 수 있습니다.
세포외 소포체(EV)는 세포 통신 및 폐기물 제거를 위해 모든 세포에서 분비되는 생물학적 나노 입자입니다. 그들은 생리학적, 병리학적 조건에서 다른 세포에 작용하고 화물을 다른 세포로 이동시킴으로써 광범위한 기능에 참여합니다. EV는 생체 유체에 존재한다는 점을 감안할 때 질병 과정을 연구하기 위한 훌륭한 자원이며 바이오마커 발견을 위한 액체 생검으로 간주될 수 있습니다. EV 분석의 매력적인 측면은 기원 세포의 마커를 기반으로 선택할 수 있으므로 화물에 있는 특정 조직의 환경을 반영할 수 있다는 것입니다. 그러나 EV 절연 방법과 관련된 주요 단점 중 하나는 방법론적 합의와 표준화된 프로토콜이 부족하다는 것입니다. 성상세포(astrocyte)는 뇌에서 필수적인 역할을 하는 신경교세포(glial cell)입니다. 신경퇴행성 질환에서 성상세포 반응은 EV 화물 및 비정상적인 세포 통신을 변경하여 질병 진행을 촉진/향상시킬 수 있습니다. 따라서 성상교세포 EV의 분석은 바이오마커 및 잠재적인 질병 표적의 발견으로 이어질 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간 혈장에서 성상세포 유래 EV(ADEV)를 농축하는 2단계 방법을 설명합니다. 첫째, EV는 폴리머 기반 침전을 통해 제세된 플라즈마에서 농축됩니다. 그 다음에는 자기 마이크로 비드를 사용한 ACSA-1 기반 면역 캡처를 통해 ADEV를 농축하며, 여기서 재현탁된 EV는 자기장에 배치된 기둥에 적재됩니다. 자기 라벨링된 ACSA-1+ EV는 컬럼 내에 유지되고 다른 EV는 통과합니다. 자석에서 컬럼이 제거되면 ADEV가 용리되어 저장 및 분석할 준비가 됩니다. 성상세포 마커의 농축을 검증하기 위해 신경교세포섬유산단백질(GFAP) 또는 세포 내 기원의 기타 특정 성상세포 마커를 용리액에서 측정하고 플로우 스루(flow-through)와 비교할 수 있습니다. 이 프로토콜은 성상세포 관련 마커를 검사하기 위한 플랫폼으로 사용할 수 있는 혈장에서 ADEV를 농축하는 쉽고 시간 효율적인 방법을 제안합니다.
세포외 소포체(EV)는 모든 유형의 세포에서 분비되는 막질 나노입자의 이질적인 그룹으로, 단백질, 지질 및 핵산을 운반합니다1. 미세소포체(100-1000 nm), 엑소좀(30-100 nm) 및 자가사멸체(1000-5000 nm)가 주요 EV 유형을 구성하며, 원산지 2,3에 따라 구별됩니다. EV는 항원 제시 및 면역 반응4, 수용체 재생, 대사 산물 제거5,세포 소통6과 같은 중요한 생리적 과정을 조절합니다. 이러한 과정의 조절은 EV 세포막에 풍부한 단백질과 수용 세포의 표적 사이의 직접 결합 및/또는 수용 세포의 세포질에서 화물의 내재화 및 방출을 통해 발생할 수 있습니다7. EV는 필수적인 세포 기능을 수행하지만 암 및 신경학 분야에서 병리학적 관점에서 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다. 실제로, 여러 연구에 따르면 EV는 종양 세포 이동을 촉진하는 데 도움이 될 수 있습니다....
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이 프로토콜에 설명된 연구는 스페인 바르셀로나에 있는 Sant Pau Initiative on Neurodegeneration(SPIN) 코호트의 남녀 건강한 성인 기증자(연령 범위 65.9-81.3세, 여성 45.5%)의 인간 혈장 샘플로 수행되었습니다. 참가자들은 정보에 입각한 동의를 했습니다. 이 연구는 헬싱키 선언과 스페인 법에 포함된 의학 연구에 대한 국제 윤리 지침에 따라 수행되었습니다. 산트 파우 연구 윤리 위원회(Sant Pau Research Ethics Committee, CEIC)는 SPIN 코호트(#16/2013)에서 인간 혈장 샘플의 수집 및 보관을 위한 프로토콜을 검토하고 승인했습니다.
1. 인간 플라즈마에서 성상세포 EV의 농축
참고: 이 프로토콜에는 인간 혈장 샘플의 사용이 포함됩니다. 이 프로토콜에 사용된 시약 및 실험실 재료에 대한 모든 세부 정보는 재료 표에 포함되어 있습니다. 이 절차에는 특별한 장비가 필요하지 않지만, 각 제조업체에서 개별적으로 지정한 대로 각 시약의 안전성 고려 사항을 검토하십시오.
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건강한 기증자로부터 채취한 혈장에서 ADEV를 분리하는 작업이 성공적으로 이루어졌습니다. 총 EV 분획을 얻기 위해 폴리머 기반 침전 방법을 사용한 다음 자기 마이크로비드를 사용한 면역 캡처를 수행하여 ADEV를 얻었습니다.
면역 포획 단계 전 총 EV 분획에 대한 웨스턴 블롯 분석은 EV 제제에 칼넥신(calnexin, 세포 오염 마커)이 부족하고 알릭스(Alix)와 막관통 단백질 CD9가 존재하는 것을 나타냈습니다(그림 2A).
면역포획 후, 수포 및 성상세포 마커의 존재 및 농축이 ADEV 분획에서 검증되었습니다. GFAP 농도는 ADEV가 없는 분획(플로우 스루)에 비해 ADEV에서 유의하게 높았으며, 6배 농축(p = 0.008)을 보여주었습니다. 이는 ADEV 분획에서 EV의 우세한 성상세포 기원을 확인합니다(그림 2B
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EV는 진단 및 치료 가능성으로 인해 생물 의학 연구에 대한 큰 관심을 얻고 있습니다. 현재 EV 격리 방법과 관련된 주요 단점 중 하나는 방법론적 합의와 표준화된 프로토콜이 부족하다는 것입니다. 이 연구는 폴리머 기반 침전 및 GLAST 면역 캡처 를 통해 인간 혈장에서 성상 세포 EV를 농축하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
EV를 체액에서 분리하기 위한 다양한 방법론이 존재하며, 각각 고유한 장점과 한계가 있습니다. 폴리머 기반 접근법은 단순성, 사용 용이성, 시간 소모적이지 않음, 특정 기기가 필요하지 않음, 높은 EV 수율 및 신경학 12,18,19,20의 EV 바이오마커 연구에 널리 사용되어 결과를 비교할 수 있기 때문에 .......
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Belbin 박사는 제출된 연구 외에 ADx NeuroSciences로부터 개인 수수료를 받았다고 보고했습니다. Alcolea 박사는 제출된 논문 외에 Fujirebio-Europe, Roche, Nurtricia, Krka Farmacéutica, Zambon S.A.U. 및 Esteve로부터 자문 위원회 서비스에 대한 개인 회비를 받았다고 보고했습니다. Lleó 박사는 제출된 연구 외에도 Fujirebio-Europe, Roche, Biogen, Grifols 및 Nutricia의 컨설턴트 또는 자문 위원회에서 활동했습니다. Fortea 박사는 제출된 논문 외에 AC Immune, Novartis, Lundbeck, Roche, Fujirebio 및 Biogen으로부터 자문 위원회, 심사 위원회 또는 연사 명예 봉사에 대한 개인 수수료를 받았다고 보고했습니다. Alcolea, Belbin, LLeó 및 Fortea 박사는 신경퇴행성 질환의 시냅토병증 마커에 대한 특허를 보유하고 있다고 보고합니다(ADx, EPI8382175.0 라이선스). 다른 공개는 보고되지 않았습니다. 다른 모든 저자는 더 이상 공개할 것이 없습니다.
저자는 시료 취급 및 준비를 위해 Soraya Torres, Shaimaa El Bounasri El Bennadi 및 Oriol Sanchez Lopez의 도움을 받은 것에 감사를 표합니다. 또한 바르셀로나 재료 과학 연구소(Barcelona Materials Science Institute)의 ICTS "NANBIOSIS", unit 6(Unit of CIBER in Bioingineering, Biomaterials & Nanomedicine)의 José Amable Bernabé, Universitat Autonoma de Barcelona의 전자 현미경 유닛의 Marti de Cabo Jaume, Sant Pau Biomedical Research Institute(IIB-Sant Pau)의 유세포 분석 플랫폼의 Marta Soler Castany 박사와 Lia Ros Blanco의 협력에 감사드립니다. IIB-Sant Pau의 지질 관련 질환 병태생리학 그룹의 Joan Carles Escolà-Gil 박사가 각각 NTA, cryo-EM, Luminex 및 ApoB 측정에 도움을 주었습니다.
저자는 Jérôme Lejeune Foundation(프로젝트 #1941 및 #1....
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| 웨스턴 블로팅을 위한 안티-칼넥신 1차 항체 | Genetex | GTX109669 | |
| 웨스턴 블로팅을 위한 Anti-CD9 1차 항체 | 세포 신호 전달 | 13174 | |
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| Bransonic 1510E-MT 초음파 수조 | Branson | ||
| COBAS 6000 자동 분석기 | Roche Diagnostics | ApoB의 면역탁도 측정을 위한 분석기; 상업용 자동 분석기 | |
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| Dulbecco의 PBS Mg++, Ca++ 무료 500 mL | Thermo Fisher | 14190144 | |
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| GeneGnome XRQ 화학발광 이미징 시스템 | Syngene | ||
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