عزل الخلايا البطانية الكبيبية للفأر الخالدة المشروطة مع الميتوكوندريا الفلورية
Summary
تصف المقالة طريقة عزل الخلايا البطانية الكبيبية الخالدة المشروطة من كليتي الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن فيروس thermolabile simian 40 والميتوكوندريا القابلة للتنشيط الضوئي ، PhAMالمستأصلة. نصف إجراء عزل الكبيبات من الكلى الكاملة باستخدام الخرز وخطوات الهضم والبذر واستزراع GECs-CD31 الإيجابي.
Abstract
يمكن أن يؤدي خلل الخلايا البطانية الكبيبية (GEC) إلى انهيار حاجز الترشيح الكبيبي والمساهمة فيه. تم اقتراح زيادة الإجهاد التأكسدي للميتوكوندريا كآلية تؤدي إلى خلل وظيفي في GEC في التسبب في بعض أمراض الكبيبات. تاريخيا ، كانت عزلة GECs من النماذج الحية صعبة للغاية بسبب الصعوبات في عزل الثقافات النقية عن الكبيبات. GECs لديها متطلبات نمو معقدة في المختبر وعمر محدود للغاية. هنا ، نصف الإجراء الخاص بعزل وزراعة GECs الخالدة المشروطة بالميتوكوندريا الفلورية ، مما يتيح تتبع أحداث انشطار الميتوكوندريا والاندماج. تم عزل GECs من كليتي فأر مزدوج معدل وراثيا يعبر عن thermolabile SV40 TAg (من Immortomouse) ، مما يعزز الانتشار المشروط وقمع تمايز الخلايا ، وبروتين فلوري قابل للتحويل الضوئي (Dendra2) في جميع الميتوكوندريا (من فأر الميتوكوندريا القابل للتنشيط الضوئي [PhAMexcised]). يسمح خط الخلية المستقر الذي تم إنشاؤه بتمايز الخلايا بعد تعطيل جين SV40 TAg التخليدي والتنشيط الضوئي لمجموعة فرعية من الميتوكوندريا مما يتسبب في تحول التألق من الأخضر إلى الأحمر. يسمح استخدام mitoDendra2-GECs بالتصوير المباشر لتوزيع الميتوكوندريا الفلورية والاندماج وأحداث الانشطار دون تلطيخ الخلايا.
Introduction
الكبيبة ضرورية لترشيح الدم عن طريق تقييد مرور الجزيئات الكبيرة عبر حاجز الترشيح الكبيبي 1,2. تحتوي الكبيبة على أربعة أنواع من الخلايا: الخلايا الظهارية الجدارية ، والخلايا الظهارية (الخلايا الظهارية الحشوية) ، والخلايا البطانية الكبيبية (GEC) ، والخلايا المتوسطة3. تتميز البطانة الكبيبية ببنية وعائية فريدة من نوعها ، وفقا لوجود fenestrae المطلوبة لأحجام الترشيح الكبيرة4. السطح القمي للبطانة الكبيبية مغطى بطبقة جليكوكاليكس سالبة الشحنة وطبقة تسمى الطبقة السطحية البطانية التي تخلق مسافة بين البطانة والدم. يوفر هذا الهيكل انتقائية عالية الشحنة تقيد مرور الجزيئات سالبة الشحنة مثل الألبومين وتمنع التصاق الكريات البيض والصفائح الدموية5.
GECs حساسة للغاية للتغيرات الأيضية ، مثل ارتفاع السكر في الدم المرتبط ببيئة السكري. في الواقع ، يؤدي مرض السكري إلى زيادة الدورة الدموية للمواد الضارة ، وتشبع مسارات استقلاب الجلوكوز ، وتوازن الأكسدة والاختزال الخلويالمضطرب 3,6. علاوة على ذلك ، فإن الزيادة في أنواع الأكسجين التفاعلية تؤدي إلى خلل في الميتوكوندريا ، مما يؤثر على وظيفة البطانة7.
الهدف العام للبروتوكول الحالي هو عزل الخلايا البطانية الكبيبية الخالدة مع ميزات الميتوكوندريا الفلورية. في الواقع ، فإن زراعة الخلايا في GECs الأولية لها دورة تكاثرية محدودة وشيخوخة مبكرة8. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد وجود الميتوكوندريا الفلورية في فحص أحداث الانشطار والاندماج استجابة لارتفاع السكر في الدم أو أي علاج آخر. كطريقة بديلة ، استخدمت مختبرات أخرى h-TERT لتخليد الخلايا في المختبر9.
تسمح الطريقة الموضحة هنا بعزل الخلايا البطانية الكبيبية mitoDendra2 الخالدة بشكل مشروط من الحيوانات التي يبلغ عمرها 4-6 أسابيع (الشكل 1). يصف هذا البروتوكول المفصل استخدام الفئران المعدلة وراثيا (H-2K b-tsA58) التي تؤوي فيروس سيميان 40 مستضد الورم الكبير (SV40 TAg) الجين10,11 لتوليد خلايا خلدة مشروطة حراريا. يعمل منتج الجين tsA58 TAg عند درجة حرارة متساهلة تبلغ 33 درجة مئوية تحت سيطرة المروج الجانبي 5 ‘للفأر H-2Kb ، والذي يزداد فوق المستويات القاعدية عند التعرض لإنترفيرون جاما (IFNγ) ، وبالتالي الحفاظ على النمط الظاهريللانتشار الشرطي 12. يتحلل H-2Kb بسرعة عند درجة حرارة غير متساهلة تبلغ 37 درجة مئوية في غياب IFNγ ، مما يزيل وظيفة تخليد tsA58Tag في الخلايا ويسمح للخلايا بتطوير نمط ظاهري أكثر تمايزا13،14،15. يسمح العبور الاختياري للفئران المعدلة وراثيا H-2Kb-tsA58 مع فئران PhAM ، والتي تعبر عن ميتوكوندريا خاصة (الوحدة الفرعية الثامنة من السيتوكروم ج أوكسيديز) Dendra2-green ، بالكشف الحي عن الميتوكوندرياالفلورية 16. يتحول مضان Dendra2 الأخضر إلى مضان أحمر بعد التعرض لليزر 405 نانومتر16. عندما تندمج الميتوكوندريا بعد تبديل الصور ، فإنها تشكل أشكالا ممدودة تظهر صفراء من تبادل المواد الخضراء والصفراء أو تظهر حمراء عندما تخضع للانشطار 7,17. تعد mitoDendra2-GECs أداة رائعة لدراسة الاستجابات الخلوية للميتوكوندريا GEC للمحفزات المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الميتوكوندريا ضرورية لعملية التمثيل الغذائي الخلوي ، والتوازن ، واستجابات الإجهاد ، ويرتبط اختلالها الوظيفي بالعديد من الأمراض ، بما في ذلك أمراض الكلى. الميتوكوندريا لها دور في التوليد المرضي لأنواع الأكسجين التفاعلية المفرطة (ROS) ، وتنظيم مستويات الكالسيوم داخل الخلايا ، ومسارات موت ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون البروفيسور سيجيانغ هي والدكتور فو جيا على رؤيتهم في عزل الخلايا البطانية للفئران ويشكرون البروفيسور مون زيدي على توفير الفئرانالمستأصلة والمناقشات القيمة. يود المؤلفون أيضا أن يعربوا عن تقديرهم ل Microscopy CORE في كلية Icahn للطب في Mount Sinai والموظفين على التوجيه الذي تلقيناه. تم دعم هذا العمل من خلال منح من منحة المعاهد الوطنية للصحة R01DK097253 ومنحة وزارة الدفاع CDMRP E01 W81XWH2010836 إلى I.S.D.
Materials
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
- Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
- Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
- Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).
- Haraldsson, B., Jeansson, M. Glomerular filtration barrier. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).
- Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
- Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
- Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
- Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
- Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics–Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).
- Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
- Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
- Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
- Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
- Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998 (2019).
- Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048 (2020).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
