蛍光ミトコンドリアによる条件付き不死化マウス糸球体内皮細胞の単離
Summary
この記事では、熱不安定性サルウイルス40および光活性化可能なミトコンドリア、PhAMを切除したトランスジェニックマウスの腎臓から条件付き不死化糸球体内皮細胞を単離する方法について説明しています。ビーズを用いた腎臓全体からの糸球体単離の手順、消化ステップ、播種、およびGECs-CD31陽性の培養について説明します。
Abstract
糸球体内皮細胞(GEC)の機能不全は、糸球体濾過バリアの破壊を開始し、一因となる可能性があります。ミトコンドリア酸化ストレスの増加は、いくつかの糸球体疾患の病因におけるGEC機能障害をもたらすメカニズムとして示唆されています。歴史的に、 in vivo モデルからのGECの単離は、糸球体から純粋な培養物を単離することが困難であるため、悪名高いほど困難でした。GECは、 in vitroでの 複雑な増殖要件と非常に限られた寿命を持っています。ここでは、ミトコンドリアの分裂および融合イベントの追跡を可能にする、蛍光ミトコンドリアを有する条件付き不死化GECを単離および培養する手順について説明します。GECは、熱不安定性SV40 TAg(イモータルトマウス由来)を発現し、条件付きで増殖を促進し、細胞分化を抑制する二重トランスジェニックマウスの腎臓から単離され、すべてのミトコンドリア(光活性化可能なミトコンドリア[PhAM切除]マウスから)の光変換蛍光タンパク質(Dendra2)を単離しました。生成された安定した細胞株は、不死化SV40 TAg遺伝子の不活性化後の細胞分化と、蛍光の緑から赤への切り替えを引き起こすミトコンドリアのサブセットの光活性化を可能にします。mitoDendra2-GECを使用することで、細胞を染色することなく、蛍光ミトコンドリアの分布、融合、および分裂イベントのライブイメージングが可能になります。
Introduction
糸球体は、糸球体濾過バリア1,2を通過する大きな分子の通過を制限することにより、血液濾過にとって重要である。糸球体には、頭頂上皮細胞、足細胞(内臓上皮細胞)、糸球体内皮細胞(GEC)、メサンギウム細胞の4つの細胞タイプが含まれています3。糸球体内皮は、大きな濾過量に必要なフェネストラの存在に従って、独特の血管構造によって特徴付けられる4。糸球体内皮の頂端表面は、負に帯電したグリコカリックス層と、内皮と血液の間に空間を作り出す内皮表面層と呼ばれるコートで覆われています。この構造は、アルブミンなどの負に帯電した分子の通過を制限し、白血球と血小板の接着を防ぐ高い電荷選択性を提供します5。
GECは、糖尿病環境に関連する高血糖などの代謝変化に非常に敏感です。実際、糖尿病は有害物質の循環の増加、グルコース代謝経路の飽和、および細胞酸化還元バランスの乱れにつながります3,6。さらに、活性酸素種の増加はミトコンドリア機能障害を誘発し、内皮機能に影響を与えます7。
現在のプロトコルの全体的な目標は、蛍光ミトコンドリアの特徴を持つ不死化糸球体内皮細胞を単離することです。実際、初代GECの細胞培養は増殖周期が限られており、老化が早い8。さらに、蛍光ミトコンドリアの存在は、高血糖または他の治療に応答して分裂および融合事象を調べるのに役立つ。別の方法として、他の研究室ではh-TERTを使用して細胞をin vitroで不死化しました9。
ここで説明する方法は、4〜6週齢の動物から条件付き不死化mitoDendra2糸球体内皮細胞を単離することを可能にする(図1)。この詳細なプロトコルは、熱不安定な条件付き不死化細胞を生成するためのサルウイルス40大腫瘍抗原(SV40TAg)遺伝子10,11を保持するトランスジェニックマウス(H-2Kb-tsA58)の使用を記載している。tsA58 TAg遺伝子産物は、マウスH-2Kb遺伝子の誘導性5’隣接プロモーターの制御下で33°Cの許容温度で機能し、インターフェロンガンマ(IFNγ)への曝露により基礎レベルを超えて増加し、したがって条件付き増殖表現型12を維持します。H-2Kbは、IFNγの非存在下で37°Cの非許容温度で急速に分解され、細胞内のtsA58Tagの不死化機能を除去し、細胞がより分化した表現型を発達させることを可能にします13,14,15。H-2Kb-tsA58トランスジェニックマウスと、ミトコンドリア特異的(シトクロムcオキシダーゼのサブユニットVIII)デンドラ2-グリーンを発現するPhAMマウスとのオプションの交配により、蛍光ミトコンドリア16のライブ検出が可能になります。Dendra2緑色蛍光は、405 nmレーザー16に曝露すると赤色蛍光に切り替わります。ミトコンドリアが光スイッチング後に融合すると、緑と黄色の物質の交換から黄色に見えるか、核分裂を起こすと赤く見える細長い形状を形成します7,17。mitoDendra2-GECは、さまざまな刺激に対するGECミトコンドリアの細胞応答を研究するための優れたツールです。
Protocol
Representative Results
Discussion
ミトコンドリアは、細胞の代謝、恒常性、ストレス応答に不可欠であり、その機能不全は腎臓病を含む多くの病気に関連しています。ミトコンドリアは、過剰な活性酸素種(ROS)の病理学的生成、細胞内カルシウムレベルの調節、細胞死経路、および細胞骨格動態に役割を果たしています21,22,23。
マウス…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、マウスの内皮細胞単離に関する洞察を提供してくれたCijiang He教授とFu Jia博士に感謝し、PhAM切除 マウスと貴重な議論を提供してくれたMone Zaidi教授に感謝しています。著者はまた、マウントサイナイのアイカーン医学部の顕微鏡COREとスタッフに、私たちが受けた指導に感謝したいと思います。この作業は、国立衛生研究所の助成金R01DK097253および国防総省CDMRP助成金E01 W81XWH2010836からのI.S.Dへの助成金によってサポートされました。
Materials
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
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