In vivo Detecção de Permeabilidade Vascular em Glândula Submandibular de Camundongo
Summary
No presente protocolo, a função de barreira endotelial da glândula submandibular (SMG) foi avaliada por meio da injeção de diferentes marcadores fluorescentes de peso molecular nas veias angulares de modelos animais de teste in vivo sob um microscópio de varredura a laser de dois fótons.
Abstract
A saliva desempenha um papel importante na saúde oral e geral. A função de barreira endotelial intacta dos vasos sanguíneos permite a secreção de saliva, enquanto a disfunção da barreira endotelial está relacionada a muitos distúrbios secretores das glândulas salivares. O presente protocolo descreve um método de detecção de permeabilidade paracelular in vivo para avaliar a função das junções endoteliais apertadas (TJs) em glândulas submandibulares de camundongos (SMG). Primeiro, dextrans marcado com fluorescência com diferentes pesos moleculares (4 kDa, 40 kDa, ou 70 kDa) foram injetados nas veias angulares de camundongos. Posteriormente, o SMG unilateral foi dissecado e fixado no suporte personalizado sob um microscópio de varredura a laser de dois fótons e, em seguida, as imagens foram capturadas para vasos sanguíneos, ácinos e dutos. Utilizando este método, o vazamento dinâmico em tempo real dos traçadores de diferentes tamanhos dos vasos sanguíneos para os lados basais dos ácinos e até mesmo através do epitélio acinar para os ductos foi monitorado para avaliar a alteração da função de barreira endotelial sob condições fisiológicas ou fisiopatológicas.
Introduction
Várias glândulas salivares produzem saliva, que atua principalmente como a primeira linha de defesa contra infecções e ajuda a digestão, desempenhando assim um papel essencial na saúde bucal e geral1. O suprimento de sangue é crucial para a secreção das glândulas salivares, uma vez que fornece constantemente água, eletrólitos e moléculas que formam a saliva primária. A função de barreira endotelial, regulada pelo complexo de junção apertada (TJ), limita estrita e delicadamente a permeação dos capilares, que são altamente permeáveis à água, solutos, proteínas e até mesmo células que se deslocam dos vasos sanguíneos circulantes para os tecidos das glândulas salivares 2,3. Descobrimos anteriormente que a abertura dos TJs endoteliais em resposta a um estímulo colinérgico facilita a secreção salivar, enquanto o comprometimento da função da barreira endotelial está interligado com hipossecreção e infiltração linfocítica nas glândulas submandibulares (SMGs) na síndrome de Sjögren4. Esses dados sugerem que a contribuição da função de barreira endotelial precisa ser prestada atenção suficiente em relação a uma variedade de doenças das glândulas salivares.
Um microscópio de varredura a laser de dois fótons é uma ferramenta poderosa para observar a dinâmica das células no tecido intacto in vivo. Uma das vantagens dessa técnica é que a luz infravermelha próxima (NIR) tem penetração tecidual mais profunda do que a luz visível ou ultravioleta quando os espécimes são excitados pelo NIR e não causa danos evidentes à luz dos tecidos sob condições apropriadas 5,6. De fato, as glândulas salivares são um tecido muito homogêneo e superficial, no qual as células acinares superficiais estão a apenas cerca de 30 μm de distância da superfície da glândula 7,8. Demonstrou-se que a microscopia confocal intravital pode estudar a secreção exócrina e o citoesqueleto de actina em glândulas salivares vivas de camundongos em resolução subcelular8. A microscopia de varredura a laser de dois fótons, no entanto, não só tem a vantagem da microscopia confocal convencional, mas também pode ser usada para detectar tecidos e imagens mais profundos com mais clareza. Aqui, o dextrans marcado por fluorescência, que é frequentemente usado como traçador de permeabilidade paracelular e tem a vantagem de diferentes tamanhos, pode ser usado para testar a magnitude do poro TJ9. No presente estudo, uma técnica intravital de microscopia a laser de dois fótons em tempo real é estabelecida para avaliação in situ da função da barreira endotelial em SMGs de camundongos. Cada etapa de trabalho para detecção de permeabilidade vascular in vivo em SMGs de camundongos é descrita no protocolo atual. Aqui está um exemplo de detecção da função de barreira endotelial no modelo de ligadura do ducto SMG do rato.
Protocol
Representative Results
Discussion
A manutenção e regulação da função de barreira endotelial são essenciais para a homeostase vascular. As células endoteliais e suas junções intercelulares desempenham um papel crítico na manutenção e controle da integridade vascular12. A força de cisalhamento do fluxo sanguíneo, fatores de crescimento e fatores inflamatórios podem causar alterações na permeabilidade vascular e, assim, participar da ocorrência e desenvolvimento de doenças sistêmicas como hipertensão, diabetes e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (bolsas 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 e 81974151) e pela Fundação de Ciências Naturais de Pequim (7202082 de subsídios).
Materials
| 2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
| 4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
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