في الجسم الحي كشف نفاذية الأوعية الدموية في الغدة تحت الفك السفلي للفأر
Summary
في البروتوكول الحالي ، تم تقييم وظيفة الحاجز البطاني للغدة تحت الفك السفلي (SMG) عن طريق حقن مقتفيات فلورية مختلفة مرجحة جزيئيا في الأوردة الزاوية لنماذج الاختبار في الجسم الحي تحت مجهر المسح بالليزر ثنائي الفوتون.
Abstract
يلعب اللعاب دورا مهما في صحة الفم والصحة العامة. تتيح وظيفة الحاجز البطاني السليمة للأوعية الدموية إفراز اللعاب ، في حين يرتبط خلل الحاجز البطاني بالعديد من اضطرابات إفراز الغدد اللعابية. يصف البروتوكول الحالي طريقة للكشف عن نفاذية الخلايا في الجسم الحي لتقييم وظيفة الوصلات الضيقة البطانية (TJs) في الغدد تحت الفك السفلي للفأر (SMG). أولا ، تم حقن dextrans المسمى بالتألق بأوزان جزيئية مختلفة (4 كيلو دالتون أو 40 كيلو دالتون أو 70 كيلو دالتون) في الأوردة الزاوية للفئران. بعد ذلك ، تم تشريح SMG أحادي الجانب وتثبيته في الحامل المخصص تحت مجهر المسح بالليزر ثنائي الفوتون ، ثم تم التقاط صور للأوعية الدموية والعنيبيات والقنوات. باستخدام هذه الطريقة ، تم رصد التسرب الديناميكي في الوقت الفعلي للمتتبعات ذات الأحجام المختلفة من الأوعية الدموية إلى الجوانب القاعدية للأسيني وحتى عبر ظهارة العنيب إلى القنوات لتقييم تغيير وظيفة الحاجز البطاني في ظل الظروف الفسيولوجية أو الفيزيولوجية المرضية.
Introduction
تنتج الغدد اللعابية المختلفة اللعاب ، الذي يعمل في المقام الأول كخط دفاع أول ضد الالتهابات ويساعد على الهضم ، وبالتالي يلعب دورا أساسيا في صحة الفم والصحة العامة1. يعد إمداد الدم أمرا بالغ الأهمية لإفراز الغدد اللعابية لأنه يوفر باستمرار الماء والكهارل والجزيئات التي تشكل اللعاب الأساسي. وظيفة الحاجز البطاني ، التي ينظمها مجمع الوصلة الضيقة (TJ) ، تحد بشكل صارم ودقيق من تغلغل الشعيرات الدموية ، والتي تكون شديدة النفاذية للماء والمواد المذابة والبروتينات وحتى الخلايا التي تنتقل من الأوعية الدموية المتداولة إلى أنسجة الغدد اللعابية 2,3. لقد وجدنا سابقا أن فتح TJs البطانية استجابة لمحفز كوليني يسهل إفراز اللعاب ، في حين أن ضعف وظيفة الحاجز البطاني مرتبط بنقص الإفراز وتسلل اللمفاويات في الغدد تحت الفك السفلي (SMGs) في متلازمة سجوجرن4. تشير هذه البيانات إلى أن مساهمة وظيفة الحاجز البطاني تحتاج إلى إيلاء اهتمام كاف فيما يتعلق بمجموعة متنوعة من أمراض الغدد اللعابية.
يعد مجهر المسح بالليزر ثنائي الفوتون أداة قوية لمراقبة ديناميكيات الخلايا في الأنسجة السليمة في الجسم الحي. تتمثل إحدى مزايا هذه التقنية في أن ضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) له اختراق أعمق للأنسجة من الضوء المرئي أو الأشعة فوق البنفسجية عندما تكون العينات متحمسة بواسطة NIR ولا تسبب أضرارا ضوئية واضحة للأنسجة في ظل الظروف المناسبة 5,6. في الواقع ، الغدد اللعابية هي نسيج متجانس وسطحي للغاية ، حيث تكون الخلايا العنيبية السطحية على بعد حوالي 30 ميكرومتر فقط من سطح الغدة 7,8. لقد ثبت أن الفحص المجهري متحد البؤر داخل الجسم يمكنه دراسة إفراز الإفرازات والهيكل الخلوي الأكتين في الغدد اللعابية للفأر الحية بدقةتحت الخلوية 8. ومع ذلك ، فإن الفحص المجهري بالليزر ثنائي الفوتون لا يتمتع فقط بميزة الفحص المجهري التقليدي متحد البؤر ولكن يمكن استخدامه أيضا للكشف عن الأنسجة العميقة والصورة بشكل أكثر وضوحا. هنا ، يمكن استخدام dextrans المسمى بالتألق ، والذي يستخدم بشكل متكرر كمتتبعات نفاذية شبه خلوية وله ميزة الأحجام المختلفة ، لاختبار حجم مسام TJ9. في هذه الدراسة ، تم إنشاء تقنية الفحص المجهري بالليزر في الوقت الحقيقي ثنائي الفوتون للتقييم في الموقع لوظيفة الحاجز البطاني في رشاشات الفئران. يتم وصف كل خطوة عمل للكشف عن نفاذية الأوعية الدموية في الجسم الحي في SMGs الماوس في البروتوكول الحالي. فيما يلي مثال على اكتشاف وظيفة الحاجز البطاني في نموذج ربط مجاري الهواء SMG للفأر.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعد صيانة وظيفة الحاجز البطاني وتنظيمها ضرورية للتوازن الوعائي. تلعب الخلايا البطانية وتقاطعاتها بين الخلايا دورا مهما في الحفاظ على سلامة الأوعية الدموية والتحكم فيها12. يمكن أن تسبب قوة القص لتدفق الدم وعوامل النمو والعوامل الالتهابية تغيرات في نفاذية الأوعية الدموية ، وب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنح 31972908 و 81991500 و 81991502 و 81771093 و 81974151) ومؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (منحة 7202082).
Materials
| 2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
| 4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
References
- Carpenter, G. H. The secretion, components, and properties of saliva. Annual Review of Food Science and Technology. 4, 267-276 (2013).
- Garrett, J. R. The proper role of nerves in salivary secretion: A review. Journal of Dental Research. 66 (2), 387-397 (1987).
- Berndt, P., et al. Tight junction proteins at the blood-brain barrier: Far more than claudin-5. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (10), 1987-2002 (2019).
- Cong, X., et al. Disruption of endothelial barrier function is linked with hyposecretion and lymphocytic infiltration in salivary glands of Sjögren’s syndrome. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1864 (10), 3154-3163 (2018).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Weigert, R. Homeostasis of the apical plasma membrane during regulated exocytosis in the salivary glands of live rodents. Bioarchitecture. 1 (5), 225-229 (2011).
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of Cell Biology. 134 (4), 1031-1049 (1996).
- Enis, D. R., et al. Induction, differentiation, and remodeling of blood vessels after transplantation of Bcl-2-transduced endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (2), 425-430 (2005).
- Wang, X., et al. Application of digital subtraction angiography in canine hindlimb arteriography. Vascular. 30 (3), 474-480 (2022).
- Trani, M., Dejana, E. New insights in the control of vascular permeability: vascular endothelial-cadherin and other players. Current Opinion in Hematology. 22 (3), 267-272 (2015).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertension Research. 31 (5), 873-879 (2008).
- Scheppke, L., et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. The Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 leads to exacerbated autoimmune arthritis through increased vascular permeability. Journal of Immunology. 184 (3), 1292-1299 (2010).
- Egawa, G., Ono, S., Kabashima, K. Intravital Imaging of vascular permeability by two-photon microscopy. Methods in Molecular Biology. 2223, 151-157 (2021).
- Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
- Schulte, D., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. The EMBO Journal. 30 (20), 4157-4170 (2011).
- Uhl, B., et al. A novel experimental approach for in vivo analyses of the salivary gland microvasculature. Frontiers in Immunology. 11, 604470 (2020).
