אין ויוו זיהוי חדירות כלי דם בבלוטה תת-מנדיבולרית של עכבר
Summary
בפרוטוקול הנוכחי, פונקציית מחסום האנדותל של הבלוטה התת-מנדיבולרית (SMG) הוערכה על ידי הזרקת עוקבים פלואורסצנטיים משוקללים מולקולריים שונים לוורידים הזוויתיים של מודלים של חיות ניסוי in vivo תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר של שני פוטונים.
Abstract
לרוק תפקיד חשוב בבריאות הפה ובבריאות הכללית. תפקוד מחסום האנדותל השלם של כלי הדם מאפשר הפרשת רוק, בעוד שתפקוד לקוי של מחסום האנדותל קשור להפרעות רבות בהפרשת בלוטת הרוק. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטת זיהוי חדירות פארא-תאית in vivo להערכת תפקודם של צמתים הדוקים של האנדותל (TJs) בבלוטות תת-מנדיבולריות של עכברים (SMG). ראשית, דקסטראנס עם תוויות פלואורסצנטיות עם משקלים מולקולריים שונים (4 kDa, 40 kDa או 70 kDa) הוזרקו לוורידים הזוויתיים של עכברים. לאחר מכן, ה-SMG החד-צדדי נותח ותוקן במחזיק המותאם אישית תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר של שני פוטונים, ולאחר מכן צולמו תמונות עבור כלי דם, אצ’יני וצינורות. באמצעות שיטה זו, נצפתה הדליפה הדינמית בזמן אמת של העוקבים בגדלים שונים מכלי הדם לצדדים הבסיסיים של האצ’יני ואפילו על פני אפיתליה האצ’ינארית לתוך הצינורות כדי להעריך את השינוי בתפקוד מחסום האנדותל בתנאים פיזיולוגיים או פתופיזיולוגיים.
Introduction
בלוטות הרוק השונות מייצרות רוק, המשמש בעיקר כקו ההגנה הראשון מפני זיהומים ומסייע לעיכול, ובכך ממלא תפקיד חיוני בבריאות הפה ובבריאות הכללית1. אספקת הדם חיונית להפרשת בלוטת הרוק מכיוון שהיא מספקת כל הזמן מים, אלקטרוליטים ומולקולות היוצרים את הרוק הראשוני. תפקוד מחסום האנדותל, המווסת על ידי קומפלקס הצומת ההדוק (TJ), מגביל בקפדנות ובעדינות את חדירתם של נימים, שהם חדירים מאוד למים, מומסים, חלבונים ואפילו תאים הנעים מכלי הדם במחזור הדם לרקמות בלוטת הרוק 2,3. מצאנו בעבר כי פתיחת ה- TJs של האנדותל בתגובה לגירוי כולינרגי מקלה על הפרשת הרוק, ואילו הפגיעה בתפקוד מחסום האנדותל קשורה להיפו-הפרשה וחדירה לימפוציטית בבלוטות התת-מנדיבולריות (SMGs) בתסמונת סיוגרן4. נתונים אלה מצביעים על כך שתרומתו של תפקוד מחסום האנדותל צריכה להיות מוקדשת מספיק תשומת לב לגבי מגוון מחלות בלוטת הרוק.
מיקרוסקופ סריקת לייזר בעל שני פוטונים הוא כלי רב עוצמה להתבוננות בדינמיקה של תאים ברקמה שלמה in vivo. אחד היתרונות של טכניקה זו הוא שלאור אינפרה-אדום קרוב (NIR) יש חדירה עמוקה יותר לרקמות מאשר לאור נראה או אולטרה סגול כאשר דגימות מעוררות על ידי NIR ואינו גורם נזק אור ברור לרקמות בתנאים מתאימים 5,6. ואכן, בלוטות הרוק הן רקמה הומוגנית ושטחית מאוד, שבה תאי האסינאר על פני השטח נמצאים במרחק של כ-30 מיקרומטר בלבד משטח הבלוטה 7,8. הוכח כי מיקרוסקופיה קונפוקלית תוך-חיונית יכולה לחקור הפרשה אקסוקרינית ושלד אקטין בבלוטות רוק של עכברים חיים ברזולוציה תת-תאית8. עם זאת, למיקרוסקופיה של סריקת לייזר דו-פוטונית יש לא רק את היתרון של מיקרוסקופיה קונפוקלית קונבנציונלית, אלא ניתן להשתמש בה גם כדי לזהות רקמות עמוקות יותר ותמונה בצורה ברורה יותר. כאן, dextrans מסומן פלואורסצנציה, אשר משמשים לעתים קרובות כמו עקבות חדירות paracellular ויש להם את היתרון של גדלים שונים, ניתן להשתמש כדי לבדוק את גודל של נקבובית TJ9. במחקר הנוכחי נקבעה טכניקת מיקרוסקופיה תוך-חיונית בזמן אמת של סריקת לייזר דו-פוטונית לצורך הערכה באתרה של תפקוד מחסום האנדותל ב-SMGs של עכברים. כל שלב עבודה עבור זיהוי חדירות כלי דם in vivo ב- SMGs עכבר מתואר בפרוטוקול הנוכחי. הנה דוגמה לזיהוי פונקציית מחסום אנדותל במודל קשירת צינור SMG של העכבר.
Protocol
Representative Results
Discussion
תחזוקה וויסות של תפקוד מחסום אנדותל חיוניים להומאוסטזיס וסקולרי. תאי האנדותל והצמתים הבין-תאיים שלהם ממלאים תפקיד קריטי בשמירה ובבקרה על שלמות כלי הדם12. כוח הגזירה של זרימת הדם, גורמי גדילה וגורמים דלקתיים יכול לגרום לשינויים בחדירות כלי הדם, ובכך להשתתף בהתרחשות והתפתחות ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענקים 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 ו-81974151) וקרן בייג’ינג למדעי הטבע (מענק 7202082).
Materials
| 2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
| 4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
References
- Carpenter, G. H. The secretion, components, and properties of saliva. Annual Review of Food Science and Technology. 4, 267-276 (2013).
- Garrett, J. R. The proper role of nerves in salivary secretion: A review. Journal of Dental Research. 66 (2), 387-397 (1987).
- Berndt, P., et al. Tight junction proteins at the blood-brain barrier: Far more than claudin-5. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (10), 1987-2002 (2019).
- Cong, X., et al. Disruption of endothelial barrier function is linked with hyposecretion and lymphocytic infiltration in salivary glands of Sjögren’s syndrome. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1864 (10), 3154-3163 (2018).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Weigert, R. Homeostasis of the apical plasma membrane during regulated exocytosis in the salivary glands of live rodents. Bioarchitecture. 1 (5), 225-229 (2011).
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of Cell Biology. 134 (4), 1031-1049 (1996).
- Enis, D. R., et al. Induction, differentiation, and remodeling of blood vessels after transplantation of Bcl-2-transduced endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (2), 425-430 (2005).
- Wang, X., et al. Application of digital subtraction angiography in canine hindlimb arteriography. Vascular. 30 (3), 474-480 (2022).
- Trani, M., Dejana, E. New insights in the control of vascular permeability: vascular endothelial-cadherin and other players. Current Opinion in Hematology. 22 (3), 267-272 (2015).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertension Research. 31 (5), 873-879 (2008).
- Scheppke, L., et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. The Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 leads to exacerbated autoimmune arthritis through increased vascular permeability. Journal of Immunology. 184 (3), 1292-1299 (2010).
- Egawa, G., Ono, S., Kabashima, K. Intravital Imaging of vascular permeability by two-photon microscopy. Methods in Molecular Biology. 2223, 151-157 (2021).
- Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
- Schulte, D., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. The EMBO Journal. 30 (20), 4157-4170 (2011).
- Uhl, B., et al. A novel experimental approach for in vivo analyses of the salivary gland microvasculature. Frontiers in Immunology. 11, 604470 (2020).
