In vivo Detección de permeabilidad vascular en glándula submandibular de ratón
Summary
En el presente protocolo, la función de barrera endotelial de la glándula submandibular (SMG) se evaluó inyectando diferentes trazadores fluorescentes ponderados molecularmente en las venas angulares de modelos animales de prueba in vivo bajo un microscopio de escaneo láser de dos fotones.
Abstract
La saliva juega un papel importante en la salud oral y general. La función de barrera endotelial intacta de los vasos sanguíneos permite la secreción de saliva, mientras que la disfunción de la barrera endotelial está relacionada con muchos trastornos secretores de las glándulas salivales. El presente protocolo describe un método de detección de permeabilidad paracelular in vivo para evaluar la función de las uniones estrechas endoteliales (TJ) en glándulas submandibulares de ratón (SMG). Primero, se inyectaron dextranos marcados con fluorescencia con diferentes pesos moleculares (4 kDa, 40 kDa o 70 kDa) en las venas angulares de ratones. Posteriormente, el SMG unilateral se diseccionó y fijó en el soporte personalizado bajo un microscopio de escaneo láser de dos fotones, y luego se capturaron imágenes de vasos sanguíneos, acinos y conductos. Utilizando este método, se monitorizó la fuga dinámica en tiempo real de los trazadores de diferentes tamaños de los vasos sanguíneos hacia los lados basales de los acinos e incluso a través del epitelio acinar hacia los conductos para evaluar la alteración de la función de barrera endotelial en condiciones fisiológicas o fisiopatológicas.
Introduction
Varias glándulas salivales producen saliva, que actúa principalmente como la primera línea de defensa contra las infecciones y ayuda a la digestión, desempeñando así un papel esencial en la salud oral y general1. El suministro de sangre es crucial para la secreción de las glándulas salivales, ya que proporciona constantemente agua, electrolitos y moléculas que forman la saliva primaria. La función de barrera endotelial, regulada por el complejo de unión estrecha (TJ), limita estricta y delicadamente la permeación de los capilares, que son altamente permeables al agua, solutos, proteínas e incluso células que se mueven desde los vasos sanguíneos circulantes hacia los tejidos de las glándulas salivales 2,3. Hemos encontrado previamente que la apertura de los TJ endoteliales en respuesta a un estímulo colinérgico facilita la secreción de saliva, mientras que el deterioro de la función de barrera endotelial está interrelacionado con la hiposecreción y la infiltración linfocítica en las glándulas submandibulares (SMG) en el síndrome de Sjögren4. Estos datos sugieren que la contribución de la función de barrera endotelial debe prestarse suficiente atención con respecto a una variedad de enfermedades de las glándulas salivales.
Un microscopio de escaneo láser de dos fotones es una herramienta poderosa para observar la dinámica de las células en el tejido intacto in vivo. Una de las ventajas de esta técnica es que la luz infrarroja cercana (NIR) tiene una penetración tisular más profunda que la luz visible o ultravioleta cuando las muestras son excitadas por NIR y no causa daño obvio a los tejidos en condiciones apropiadas 5,6. De hecho, las glándulas salivales son un tejido muy homogéneo y superficial, en el que las células acinares superficiales están a sólo unos 30 μm de distancia de la superficie de la glándula 7,8. Se ha demostrado que la microscopía confocal intravital puede estudiar la secreción exocrina y el citoesqueleto de actina en glándulas salivales de ratón vivas a resolución subcelular8. Sin embargo, la microscopía de barrido láser de dos fotones no solo tiene la ventaja de la microscopía confocal convencional, sino que también se puede usar para detectar tejidos e imágenes más profundos con mayor claridad. Aquí, los dextranos marcados con fluorescencia, que se utilizan con frecuencia como trazadores de permeabilidad paracelular y tienen la ventaja de diferentes tamaños, se pueden usar para probar la magnitud del poro TJ9. En el presente estudio, se establece una técnica intravital de microscopía de barrido láser de dos fotones en tiempo real para la evaluación in situ de la función de barrera endotelial en SMG de ratón. Cada paso de trabajo para la detección de permeabilidad vascular in vivo en SMG de ratón se describe en el protocolo actual. Aquí hay un ejemplo de detección de la función de barrera endotelial en el modelo de ligadura del conducto SMG del ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
El mantenimiento y la regulación de la función de barrera endotelial son esenciales para la homeostasis vascular. Las células endoteliales y sus uniones intercelulares juegan un papel crítico en el mantenimiento y control de la integridad vascular12. La fuerza de corte del flujo sanguíneo, los factores de crecimiento y los factores inflamatorios pueden causar cambios en la permeabilidad vascular y, por lo tanto, participar en la ocurrencia y desarrollo de enfermedades sistémicas como hiperte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 y 81974151) y la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (subvención 7202082).
Materials
| 2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
| 4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
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