في طرق Ovo و Ex Ovo لدراسة تطور الأذن الداخلية للطيور
Summary
الفرخ هو كائن نموذجي فعال من حيث التكلفة ويمكن الوصول إليه ومتاح على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من الدراسات. هنا ، يتم تفصيل سلسلة من البروتوكولات لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور الأذن الداخلية للطيور وتجديدها.
Abstract
تدرك الأذن الداخلية الصوت وتحافظ على التوازن باستخدام القوقعة والدهليز. يقوم بذلك باستخدام نوع خلية حسية ميكانيكية مخصصة تعرف باسم خلية الشعر. أدت الأبحاث الأساسية في الأذن الداخلية إلى فهم عميق لكيفية عمل خلايا الشعر ، وكيف يمكن أن يؤدي عدم التنظيم إلى فقدان السمع والدوار. بالنسبة لهذا البحث ، كان الماوس هو النظام النموذجي البارز. ومع ذلك ، فقدت الفئران ، مثل جميع الثدييات ، القدرة على استبدال خلايا الشعر. وبالتالي ، عند محاولة فهم العلاجات الخلوية لاستعادة وظيفة الأذن الداخلية ، يمكن أن توفر الدراسات التكميلية في أنواع الفقاريات الأخرى مزيدا من الأفكار. الظهارة السمعية للطيور ، الحليمة القاعدية (BP) ، هي ورقة من الظهارة تتكون من خلايا شعرية حسية ميكانيكية (HCs) مقحمة بخلايا داعمة (SCs). على الرغم من اختلاف البنية التشريحية للحليمة القاعدية وقوقعة الثدييات ، إلا أن الآليات الجزيئية لتطور الأذن الداخلية والسمع متشابهة. هذا يجعل الحليمة القاعدية نظاما مفيدا ليس فقط للدراسات المقارنة ولكن أيضا لفهم التجديد. هنا ، نصف تقنيات التشريح والتلاعب للأذن الداخلية للدجاج. تظهر هذه التقنية طرق تثبيط الجزيئات الجينية والصغيرة ، والتي توفر أداة قوية لدراسة الآليات الجزيئية لتطور الأذن الداخلية. في هذه الورقة ، نناقش في تقنيات التثقيب الكهربائي للبيض لاضطراب الحليمة القاعدية وراثيا باستخدام حذف CRIPSR-Cas9 ، يليه تشريح الحليمة القاعدية. نوضح أيضا ثقافة أعضاء BP والاستخدام الأمثل لمصفوفات الثقافة ، لمراقبة تطور الظهارة وخلايا الشعر.
Introduction
الأذن الداخلية لجميع الفقاريات مشتقة من ظهارة بسيطة تعرف باسم placode 1,2. سيؤدي ذلك إلى ظهور جميع العناصر الهيكلية وأنواع الخلايا اللازمة لتحويل المعلومات الحسية الميكانيكية المرتبطة بإدراك السمع والتوازن. خلايا الشعر (HCs) ، المستشعر المهدبي للأذن الداخلية ، محاطة بخلايا داعمة (SCs). تنقل HCs المعلومات إلى الدماغ الخلفي السمعي من خلال الخلايا العصبية للعصب القحفي الثامن. يتم إنشاؤها أيضا من placode3 الأذنية. يتم تحقيق النقل الأولي للصوت على السطح القمي ل HC السمعي ، من خلال حزمة شعر حساسة ميكانيكيا4. يتم التوسط في ذلك من خلال نتوءات معدلة قائمة على الأكتين تسمى stereocilia، والتي يتم ترتيبها في نمط درجمتدرج 5. بالإضافة إلى ذلك ، ينظم الكيليوم الأولي المعدل ، المسمى kinocilium ، تكوين حزمة الشعر وهو مجاور لأطول صف من الأهداب المجسمة6،7،8. تعد بنية الأهداب الفراغية أمرا بالغ الأهمية لهذا الدور في تحويل المحفزات الميكانيكية المشتقة من الطاقة الصوتية إلى إشارات عصبية كهربائية9. يمكن أن يؤدي تلف HC السمعي من خلال الشيخوخة أو العدوى أو صدمة الأذن الصوتية أو الصدمة السامة للأذن إلى فقدان السمع الجزئي أو الكامل الذي لا رجعة فيه في الثدييات10.
تم اقتراح علاجات الاستبدال الخلوي التي قد تصلح مثل هذا الضرر11,12. كان نهج هذا البحث هو فهم التطور الطبيعي لخلية شعر الثدييات والسؤال عما إذا كان يمكن إعادة بدء برامج التطوير في الخلايا الشبيهة بالسلف التي قد تكون موجودة داخل الأذن الداخلية13. كان النهج الثاني هو النظر خارج الثدييات ، إلى الفقاريات غير الثديية التي يحدث فيها تجديد قوي لخلايا الشعر السمعية ، مثل الطيور14,15. في الطيور ، يحدث تجديد خلايا الشعر في الغالب من خلال إزالة تمايز الخلية الداعمة إلى حالة تشبه السلف ، يليها الانقسام الانقسامي غير المتماثل لتوليد خلية شعرية وخلية داعمة16. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ أيضا التمايز المباشر للخلية الداعمة لتوليد خلية شعرية17.
في حين أن آليات التطور السمعي للطيور تظهر أوجه تشابه كبيرة مع تلك الخاصة بالثدييات ، إلا أن هناك اختلافات18. يظهر تمايز HC و SC في الفرخ BP من اليوم الجنيني (E) 7 ، ويصبح أكثر وضوحا بمرور الوقت. بواسطة E12 ، يمكن تصور الحليمة القاعدية ذات النمط الجيد والاستقطاب الجيد (BP) ، وبواسطة E17 يمكن رؤية خلايا الشعر المتطورةجيدا 19. توفر هذه النقاط الزمنية نوافذ على آليات التمايز والزخرفة والقطبية ، بالإضافة إلى نضوج خلايا الشعر. من المهم فهم ما إذا كانت هذه الآليات محفوظة أو متباينة ، لأنها توفر نظرة ثاقبة للتماثل العميق لأصول خلايا الشعر الحسية الميكانيكية.
هنا ، نعرض مجموعة من التقنيات التي يتم إجراؤها في المراحل الجنينية المبكرة والمتأخرة لدراسة العمليات الخلوية مثل الانتشار ، وتحديد مصير ، والتمايز ، والأنماط ، والصيانة طوال تطور عضو الأذن الداخلية. هذا يكمل البروتوكولات الأخرى لفهم تطور الأذن الداخلية في زراعة النباتات20،21،22. نناقش أولا إدخال الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي الخارجي في سلائف BP داخل كيس الأذن E3.5 باستخدام التثقيب الكهربائي للبيض. على الرغم من أن التلاعب الجيني يمكن أن يوفر رؤى قيمة ، إلا أن الأنماط الظاهرية المتولدة على هذا النحو يمكن أن تكون متعددة الاتجاهات وبالتالي مربكة. هذا صحيح بشكل خاص أثناء تطور الأذن الداخلية في وقت لاحق ، حيث تلعب العمليات الأساسية مثل إعادة تشكيل الهيكل الخلوي أدوارا متعددة في انقسام الخلايا ، وتشكل الأنسجة ، والتخصص الخلوي. نقدم بروتوكولات للتثبيط الدوائي في النباتات المستزرعة ، والتي توفر مزايا في التحكم في الجرعة وتوقيت العلاج ومدته ، مما يوفر معالجة زمانية مكانية دقيقة لآليات النمو.
يمكن استخدام طرق زراعة الأعضاء المختلفة اعتمادا على مدة علاج المثبطات الصغيرة. نوضح هنا طريقتين لزراعة الأعضاء تسمح بإلقاء نظرة ثاقبة على التشكل الظهاري والتخصص الخلوي. طريقة لثقافة 3D باستخدام الكولاجين كمصفوفة لثقافة قناة القوقعة تمكن من زراعة قوية والتصور الحي ل BP النامية. لفهم تكوين الأهداب المجسمة ، نقدم طريقة زراعة الغشاء بحيث يتم استزراع الأنسجة الظهارية على مصفوفة صلبة تمكن نتوءات الأكتين من النمو بحرية. تسمح كلتا الطريقتين بالمعالجة النهائية مثل تصوير الخلايا الحية ، والكيمياء المناعية ، والمسح المجهري الإلكتروني (SEM) ، وتسجيل الخلايا ، وما إلى ذلك. توفر هذه التقنيات خارطة طريق للاستخدام الفعال للفرخ كنظام نموذجي لفهم ومعالجة تطور ونضج وتجديد ظهارة الطيور السمعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الفرخ هو إضافة فعالة من حيث التكلفة ومريحة للكائنات النموذجية التي قد يستخدمها المختبر للبحث في الأذن الداخلية. تستخدم الطرق الموضحة هنا بشكل روتيني في مختبرنا وتكمل الأبحاث الجارية في الأذن الداخلية للثدييات. في التثقيب الكهربائي للبيض يستخدم لإدخال التلاعب الجيني في جينوم الفرخ. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف بامتنان بالدعم المقدم من NCBS و TIFR و Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant و DST-SERB والمعهد الوطني الملكي للصم. نود أن نشكر المنظمة المركزية لتنمية الدواجن ومعهد التدريب ، هيساراغاتا ، بنغالورو. نحن ممتنون لمرافق CIFF و EM ودعم المختبرات في NCBS. نشكر يوشيكو تاكاهاشي وكويتشي كاواكامي على بنيات Tol2-eGFP و T2TP ، وجاي ريتشاردسون على الجسم المضاد HCA و G19 Pcdh15. نحن ممتنون لأعضاء Earlab لدعمهم المستمر وملاحظاتهم القيمة على البروتوكول.
Materials
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
References
- Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
- Driver, E. C., Kelley, M. W. Development of the cochlea. Development. 147 (12), (2020).
- Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).
- Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
- Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
- Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
- May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1 (2012).
- Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833 (2016).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
- Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
- Edge, A. S., Chen, Z. Y. Hair cell regeneration. Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).
- Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
- Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
- Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
- Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
- Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. 발생학. 116 (1), 119-129 (1986).
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
- Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O’Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
- Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. 발생학. 432 (1), 86-97 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. 발생학. 305 (2), 616-624 (2007).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
- Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
- Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
- Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
- Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
- Funahashi, J., Nakamura, H. Electroporation in avian embryos. Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
- Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
- Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312 (2020).
