I Ovo og Ex Ovo metoder til undersøgelse af aviær indre øre udvikling
Summary
Kyllingen er en omkostningseffektiv, tilgængelig og bredt tilgængelig modelorganisme til en række undersøgelser. Her er en række protokoller detaljeret for at forstå de molekylære mekanismer, der ligger til grund for udvikling og regenerering af fugle i det indre øre.
Abstract
Det indre øre opfatter lyd og opretholder balance ved hjælp af cochlea og vestibule. Det gør det ved hjælp af en dedikeret mekanosensorisk celletype kendt som hårcellen. Grundforskning i det indre øre har ført til en dyb forståelse af, hvordan hårcellen fungerer, og hvordan dysregulering kan føre til høretab og svimmelhed. Til denne forskning har musen været det fremtrædende modelsystem. Mus har dog, som alle pattedyr, mistet evnen til at erstatte hårceller. Når man forsøger at forstå cellulære terapier til genoprettelse af indre ørefunktion, kan komplementære undersøgelser i andre hvirveldyrarter således give yderligere indsigt. Det auditive epitel af fugle, basilar papilla (BP), er et ark epitel sammensat af mekanosensoriske hårceller (HC’er) interkaleret af understøttende celler (SC’er). Selvom den anatomiske arkitektur af basilar papilla og pattedyr cochlea er forskellige, er de molekylære mekanismer for indre øreudvikling og hørelse ens. Dette gør basilar papilla til et nyttigt system til ikke kun sammenlignende undersøgelser, men også til at forstå regenerering. Her beskriver vi dissektions- og manipulationsteknikker til kyllingens indre øre. Teknikken viser genetiske og små molekylehæmningsmetoder, som tilbyder et potent værktøj til at studere de molekylære mekanismer i udviklingen af det indre øre. I dette papir diskuterer vi i ovo elektroporationsteknikker til genetisk at forstyrre basilarpapillen ved hjælp af CRIPSR-Cas9-deletioner efterfulgt af dissektion af basilarpapillen. Vi demonstrerer også BP-organkulturen og optimal brug af kulturmatricer for at observere udviklingen af epitelet og hårcellerne.
Introduction
Det indre øre af alle hvirveldyr er afledt af et simpelt epitel kendt som den otiske placode 1,2. Dette vil give anledning til alle de strukturelle elementer og de celletyper, der er nødvendige for at transducere de mekanosensoriske oplysninger, der er forbundet med hørelse og balanceopfattelse. Hårceller (HC’er), den cilierede sensor i det indre øre, er omgivet af understøttende celler (SC’er). HC’er videresender information til den auditive baghjerne gennem neuronerne i den ottende kraniale nerve. Disse genereres også fra den otiske placode3. Den primære transduktion af lyd opnås ved den apikale overflade af den auditive HC gennem et mekanisk følsomt hårbundt4. Dette formidles gennem modificerede actinbaserede fremspring kaldet stereocilia, som er arrangeret i et gradueret trappemønster5. Derudover organiserer et modificeret primært cilium, kaldet kinocilium, hårbundtdannelse og støder op til den højeste række stereocilia 6,7,8. Stereocilias arkitektur er afgørende for denne rolle i at konvertere mekaniske stimuli afledt af akustisk energi til elektriske neurale signaler9. Skader på den auditive HC gennem aldring, infektion, otoakustisk traume eller ototoksisk shock kan resultere i delvist eller fuldstændigt høretab, der hos pattedyr er irreversibelt10.
Cellulære erstatningsterapier er blevet foreslået, der kan reparere sådanne skader11,12. Tilgangen til denne forskning har været at forstå den normale udvikling af pattedyrs hårcelle og spørge, om udviklingsprogrammer kan genoptages i stamfaderlignende celler, der kan eksistere i det indre øre13. En anden tilgang har været at se uden for pattedyr, til ikke-pattedyrs hvirveldyr, hvor robust regenerering af auditive hårceller finder sted, såsom fugle14,15. Hos fugle forekommer hårcelleregenerering overvejende gennem dedifferentiering af en understøttende celle til en stamfaderlignende tilstand efterfulgt af asymmetrisk mitotisk opdeling for at generere en hårcelle og understøttende celle16. Derudover er direkte differentiering af en understøttende celle til at generere en hårcelle også blevet observeret17.
Mens mekanismerne for fugleauditiv udvikling viser betydelige ligheder med pattedyrs, er der forskelle18. HC- og SC-differentieringen i kyllingen BP er tydelig fra fosterdagen (E) 7 og bliver mere tydelig over tid. Ved E12 kan en velmønstret og velpolariseret basilarpapilla (BP) visualiseres, og ved E17 kan veludviklede hårceller ses19. Disse tidspunkter giver vinduer ind i mekanismerne for differentiering, mønster og polaritet samt hårcellemodning. Det er vigtigt at forstå, om sådanne mekanismer er bevaret eller divergerende, da de giver indsigt i den dybe homologi af oprindelsen af mekanosensoriske hårceller.
Her demonstrerer vi en række teknikker udført på tidlige og sene embryonale stadier for at studere cellulære processer såsom spredning, skæbnespecifikation, differentiering, mønster og vedligeholdelse gennem udviklingen af det indre øreorgan. Dette supplerer andre protokoller til forståelse af indre øreudvikling i explantkultur20,21,22. Vi diskuterer først introduktionen af eksogent DNA eller RNA i BP-prækursorer inden for E3.5 otocyst ved anvendelse i ovo-elektroporation. Selvom genetiske manipulationer kan give værdifuld indsigt, kan de således genererede fænotyper være pleiotropiske og følgelig forvirrende. Dette gælder især under senere udvikling af indre øre, hvor grundlæggende processer såsom cytoskeletal ombygning spiller flere roller i celledeling, vævsmorfogenese og cellulær specialisering. Vi præsenterer protokoller for farmakologisk hæmning i dyrkede explants, som giver fordele ved at kontrollere dosering og behandlingstid og varighed, hvilket giver præcis spatiotemporal manipulation af udviklingsmekanismer.
Forskellige organkulturmetoder kan anvendes afhængigt af behandlingsvarigheden af små hæmmere. Her demonstrerer vi to metoder til organkultur, der giver indsigt i epitelmorfogenese og cellulær specialisering. En metode til 3D-kultur ved hjælp af kollagen som en matrix til dyrkning af cochlear-kanalen muliggør robust dyrkning og levende visualisering af den udviklende BP. For at forstå dannelsen af stereocilia præsenterer vi en membrankulturmetode, således at epitelvæv dyrkes på en stiv matrix, der gør det muligt for actinfremspring at vokse frit. Begge metoder tillader downstream-behandling såsom levende cellebilleddannelse, immunohistokemi, scanningselektronmikroskopi (SEM), celleoptagelse osv. Disse teknikker giver en køreplan for effektiv brug af kyllingen som et modelsystem til at forstå og manipulere udviklingen, modningen og regenereringen af fugleens auditive epitel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kyllingen er en omkostningseffektiv og bekvem tilføjelse til de modelorganismer, som et laboratorium kan bruge til at undersøge det indre øre. De metoder, der er beskrevet her, anvendes rutinemæssigt i vores laboratorium og supplerer løbende forskning i pattedyrs indre øre. I ovo elektroporation bruges til at indføre genetiske manipulationer i kyllingens genom. Elektroporation kan også bruges til at introducere konstruktioner, der koder for fluorescerende proteiner målrettet mod bestemte organeller elle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender taknemmeligt støtte fra NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB og Royal National Institute for the Deaf. Vi vil gerne takke Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru. Vi er taknemmelige for CIFF og EM facilitet og lab support på NCBS. Vi takker Yoshiko Takahashi og Koichi Kawakami for Tol2-eGFP- og T2TP-konstruktionerne og Guy Richardson for HCA- og G19 Pcdh15-antistoffet. Vi er taknemmelige for Earlab-medlemmer for deres konstante støtte og værdifulde feedback på protokollen.
Materials
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
References
- Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
- Driver, E. C., Kelley, M. W. Development of the cochlea. Development. 147 (12), (2020).
- Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).
- Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
- Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
- Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
- May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1 (2012).
- Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833 (2016).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
- Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
- Edge, A. S., Chen, Z. Y. Hair cell regeneration. Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).
- Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
- Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
- Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
- Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
- Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. 발생학. 116 (1), 119-129 (1986).
- Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
- Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O’Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
- Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. 발생학. 432 (1), 86-97 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. 발생학. 305 (2), 616-624 (2007).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
- Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
- Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
- Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
- Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
- Funahashi, J., Nakamura, H. Electroporation in avian embryos. Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
- Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
- Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312 (2020).
