Méthodes in ovo et ex ovo pour étudier le développement de l’oreille interne aviaire

Summary

Le poussin est un organisme modèle rentable, accessible et largement disponible pour une variété d’études. Ici, une série de protocoles est détaillée pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement et à la régénération de l’oreille interne aviaire.

Abstract

L’oreille interne perçoit le son et maintient l’équilibre à l’aide de la cochlée et du vestibule. Il le fait en utilisant un type de cellule mécanosensorielle dédié connu sous le nom de cellule ciliée. La recherche fondamentale dans l’oreille interne a conduit à une compréhension approfondie du fonctionnement des cellules ciliées et de la façon dont la dérégulation peut entraîner une perte auditive et des vertiges. Pour cette recherche, la souris a été le système modèle prééminent. Cependant, les souris, comme tous les mammifères, ont perdu la capacité de remplacer les cellules ciliées. Ainsi, en essayant de comprendre les thérapies cellulaires pour restaurer la fonction de l’oreille interne, des études complémentaires chez d’autres espèces de vertébrés pourraient fournir des informations supplémentaires. L’épithélium auditif des oiseaux, la papille basilaire (BP), est une feuille d’épithélium composée de cellules ciliées mécanosensorielles (HC) intercalées par des cellules de soutien (SC). Bien que l’architecture anatomique de la papille basilaire et de la cochlée des mammifères diffère, les mécanismes moléculaires du développement de l’oreille interne et de l’audition sont similaires. Cela fait de la papille basilaire un système utile non seulement pour les études comparatives, mais aussi pour comprendre la régénération. Ici, nous décrivons les techniques de dissection et de manipulation pour l’oreille interne du poulet. La technique montre des méthodes génétiques et d’inhibition de petites molécules, qui offrent un outil puissant pour étudier les mécanismes moléculaires du développement de l’oreille interne. Dans cet article, nous discutons des techniques d’électroporation in ovo pour perturber génétiquement la papille basilaire en utilisant des délétions CRIPSR-Cas9, suivies d’une dissection de la papille basilaire. Nous démontrons également la culture d’organes BP et l’utilisation optimale des matrices de culture, pour observer le développement de l’épithélium et des cellules ciliées.

Introduction

L’oreille interne de tous les vertébrés est dérivée d’un épithélium simple connu sous le nom de placode otique ^1,2. Cela donnera naissance à tous les éléments structurels et aux types de cellules nécessaires pour transduire les informations mécanosensorielles associées à la perception de l’audition et de l’équilibre. Les cellules ciliées (HC), le capteur cilié de l’oreille interne, sont entourées de cellules de soutien (SC). Les HC transmettent l’information au cerveau postérieur auditif par l’intermédiaire des neurones du huitième nerf crânien. Ceux-ci sont également générés à partir du placode otique³. La transduction primaire du son est réalisée à la surface apicale du HC auditif, à travers un faisceau pileux mécaniquement sensible⁴. Ceci est médié par des protubérances modifiées à base d’actine appelées stéréocils, qui sont disposées dans un modèle d’escalier gradué⁵. De plus, un cil primaire modifié, appelé kinocilium, organise la formation de faisceaux de cheveux et est adjacent à la plus haute rangée de stéréocils ^6,7,8. L’architecture des stéréocils est essentielle pour ce rôle dans la conversion des stimuli mécaniques dérivés de l’énergie acoustique en signaux neuronaux électriques⁹. Les dommages causés au HC auditif par le vieillissement, une infection, un traumatisme otoacoustique ou un choc ototoxique peuvent entraîner une perte auditive partielle ou complète qui, chez les mammifères, est irréversible¹⁰.

Des thérapies de remplacement cellulaire ont été proposées qui pourraient réparer ces dommages^11,12. L’approche de cette recherche a été de comprendre le développement normal de la cellule ciliée des mammifères et de se demander si les programmes de développement peuvent être réinitiés dans les cellules de type progéniteur qui peuvent exister dans l’oreille interne¹³. Une deuxième approche a consisté à regarder en dehors des mammifères, vers les vertébrés non mammifères chez lesquels une régénération robuste des cellules ciliées auditives a lieu, comme les oiseaux^14,15. Chez les oiseaux, la régénération des cellules ciliées se produit principalement par la dédifférenciation d’une cellule de soutien à un état de progéniteur, suivie d’une division mitotique asymétrique pour générer une cellule ciliée et une cellule de soutien¹⁶. De plus, une différenciation directe d’une cellule de soutien pour générer une cellule ciliée a également été observée¹⁷.

Bien que les mécanismes du développement auditif aviaire présentent des similitudes significatives avec celui des mammifères, il existe des différences¹⁸. La différenciation HC et SC chez le poussin BP est apparente dès le jour embryonnaire (E) 7, devenant plus nette au fil du temps. Par E12, une papille basilaire (BP) bien structurée et bien polarisée peut être visualisée, et par E17, des cellules ciliées bien développées peuvent être vues¹⁹. Ces points temporels fournissent des fenêtres sur les mécanismes de différenciation, de modelage et de polarité, ainsi que sur la maturation des cellules ciliées. Il est important de comprendre si de tels mécanismes sont conservés ou divergents, car ils permettent de mieux comprendre l’homologie profonde des origines des cellules ciliées mécanosensorielles.

Ici, nous démontrons un éventail de techniques effectuées aux stades embryonnaires précoces et tardifs pour étudier les processus cellulaires tels que la prolifération, la spécification du destin, la différenciation, la structuration et le maintien tout au long du développement de l’organe de l’oreille interne. Cela complète d’autres protocoles sur la compréhension du développement de l’oreille interne dans la culture explant^20,21,22. Nous discutons d’abord de l’introduction d’ADN ou d’ARN exogène dans les précurseurs de la PA dans l’otocyste E3.5 en utilisant l’électroporation in ovo. Bien que les manipulations génétiques puissent fournir des informations précieuses, les phénotypes ainsi générés peuvent être pléiotropes et par conséquent confondants. Cela est particulièrement vrai au cours du développement ultérieur de l’oreille interne, où des processus fondamentaux tels que le remodelage cytosquelettique jouent de multiples rôles dans la division cellulaire, la morphogenèse tissulaire et la spécialisation cellulaire. Nous présentons des protocoles d’inhibition pharmacologique dans les explants cultivés, qui offrent des avantages dans le contrôle de la posologie et du moment et de la durée du traitement, offrant une manipulation spatio-temporelle précise des mécanismes de développement.

Différentes méthodes de culture d’organes peuvent être utilisées en fonction de la durée du traitement des petits inhibiteurs. Nous démontrons ici deux méthodes de culture d’organes qui permettent de mieux comprendre la morphogenèse épithéliale et la spécialisation cellulaire. Une méthode de culture 3D utilisant le collagène comme matrice pour cultiver le canal cochléaire permet une culture robuste et une visualisation en direct de la PA en développement. Pour comprendre la formation des stéréocils, nous présentons une méthode de culture membranaire telle que le tissu épithélial est cultivé sur une matrice rigide permettant aux protubérances d’actine de se développer librement. Les deux méthodes permettent un traitement en aval tel que l’imagerie de cellules vivantes, l’immunohistochimie, la microscopie électronique à balayage (MEB), l’enregistrement cellulaire, etc. Ces techniques fournissent une feuille de route pour l’utilisation efficace du poussin comme système modèle pour comprendre et manipuler le développement, la maturation et la régénération de l’épithélium auditif aviaire.

Protocol

Les protocoles impliquant l’achat, la culture et l’utilisation d’œufs de poule fécondés et d’embryons non éclos ont été approuvés par le Comité institutionnel d’éthique animale du Centre national des sciences biologiques, Bengaluru, Karnataka. 1. Électroporation in ovo de précurseurs auditifs de poussins Conception et clonage de sgRNA pour l’élimination du gène CRISPR/Cas9Pour créer des knockouts de gènes, la conception gui…

Representative Results

Dans la configuration d’électroporation, le positionnement des électrodes peut jouer un rôle dans le domaine de la transfection. L’électrode positive est placée sous le jaune et le négatif au-dessus de l’embryon (Figure 1A). Il en résulte une expression plus élevée de la GFP dans une grande partie de l’oreille interne et des organes vestibulaires (Figure 1B) et de la papille basilaire auditive (Figure 1C, D<…

Discussion

Le poussin est un ajout rentable et pratique aux organismes modèles qu’un laboratoire peut utiliser pour faire des recherches sur l’oreille interne. Les méthodes décrites ici sont couramment utilisées dans notre laboratoire et complètent les recherches en cours dans l’oreille interne des mammifères. L’électroporation in ovo est utilisée pour introduire des manipulations génétiques dans le génome du poussin. L’électroporation peut également être utilisée pour introduire des constructions …

Materials

Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22287
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3	Integrated DNA Technologies	1081061	High fidelity Cas9 protein
Anti-GFP antibody	Abcam	ab290	Rabbit polyclonal to GFP
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Calcium Chloride Dihydrate	Thermo Fisher Scientific	Q12135
Collagen I, rat tail	Thermo Fisher Scientific	A1048301
Critical Point Dryer Leica EM CPD300	Leica
CUY-21 Electroporator	Nepagene
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DM5000B Widefield Microscope	Leica
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	10569010
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252
Fluoroshield	Sigma-Aldrich	F6182
FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope	Olympus
Glutaraldehyde (25 %)	Sigma-Aldrich	340855
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11001
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11008
Goat Serum Sterile filtered	HiMedia	RM10701	Heat inactivated
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	14025092
LSM980 Airyscan Microscope	Zeiss
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm	Sigma-Aldrich	PICM03050
MVX10 Stereo Microscope	Olympus
MYO7A antibody	DSHB	138-1	Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa
MZ16 Dissecting microscope	Leica
N-2 Supplement (100X)	Thermo Fisher Scientific	17502048
Noyes Scissors, 14cm (5.5'')	World Precision Instruments	501237
Osmium tetroxide (4%)	Sigma-Aldrich	75632
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PC-10 Puller	Narishige
pcU6_1sgRNA	Addgene	92395	Mini vector with modified chicken U6 promoter
Penicillin G sodium salt	Sigma-Aldrich	P3032
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36934
SMZ1500 Dissecting microscope	Nikon
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M	Electron Microscopy Sciences	11652
Sodium chloride	HiMedia	GRM853
Sputtre Coater K550X	Emitech
Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament	World Precision Instruments	1B100-3
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097
The MERLIN Compact VP	Zeiss
Thiocarbohydrazide	Alfa Aesar	L01205
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379