In Ovo e Ex Ovo Métodos para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário

Summary

O pintinho é um organismo modelo econômico, acessível e amplamente disponível para uma variedade de estudos. Aqui, uma série de protocolos é detalhada para entender os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e regeneração do ouvido interno das aves.

Abstract

O ouvido interno percebe o som e mantém o equilíbrio usando a cóclea e o vestíbulo. Ele faz isso usando um tipo de célula mecanossensorial dedicada conhecida como célula ciliada. A pesquisa básica no ouvido interno levou a uma compreensão profunda de como as células ciliadas funcionam e como a desregulação pode levar à perda auditiva e vertigem. Para esta pesquisa, o mouse tem sido o sistema modelo proeminente. No entanto, os ratos, como todos os mamíferos, perderam a capacidade de substituir as células ciliadas. Assim, ao tentar entender as terapias celulares para restaurar a função do ouvido interno, estudos complementares em outras espécies de vertebrados poderiam fornecer mais insights. O epitélio auditivo de aves, a papila basilar (PA), é uma folha de epitélio composta por células ciliadas mecanossensoriais (HCs) intercaladas por células de suporte (SCs). Embora a arquitetura anatômica da papila basilar e da cóclea de mamíferos difiram, os mecanismos moleculares do desenvolvimento da orelha interna e da audição são semelhantes. Isso torna a papila basilar um sistema útil não apenas para estudos comparativos, mas também para entender a regeneração. Aqui, descrevemos técnicas de dissecação e manipulação para o ouvido interno da galinha. A técnica mostra métodos genéticos e de inibição de moléculas pequenas, que oferecem uma ferramenta potente para estudar os mecanismos moleculares do desenvolvimento do ouvido interno. Neste trabalho, discutimos em ovo-eletroporação técnicas para perturbar geneticamente a papila basilar utilizando deleções CRIPSR-Cas9, seguidas de dissecção da papila basilar. Também demonstramos a cultura de órgãos da PA e o uso ideal das matrizes de cultura, para observar o desenvolvimento do epitélio e das células ciliadas.

Introduction

A orelha interna de todos os vertebrados é derivada de um epitélio simples conhecido como placode ótico ^1,2. Isso dará origem a todos os elementos estruturais e aos tipos de células necessários para transduzir a informação mecanossensorial associada à audição e à percepção de equilíbrio. As células ciliadas (HCs), o sensor ciliado do ouvido interno, são cercadas por células de suporte (SCs). Os HCs transmitem informações para o rombencéfalo auditivo através dos neurônios do oitavo nervo craniano. Estes também são gerados a partir do placode ótico³. A transdução primária do som é realizada na superfície apical do HC auditivo, através de um feixe capilar mecanicamente sensível⁴. Isso é mediado por meio de saliências modificadas à base de actina chamadas estereocílios, que são dispostas em um padrão de escada graduada⁵. Além disso, um cílio primário modificado, chamado de cinocílio, organiza a formação de feixes capilares e é adjacente à fileira mais alta de estereocílios ^6,7,8. A arquitetura dos estereocílios é fundamental para esse papel na conversão de estímulos mecânicos derivados da energia acústica em sinais neurais elétricos⁹. Danos à HC auditiva por envelhecimento, infecção, trauma otoacústico ou choque ototóxico podem resultar em perda auditiva parcial ou completa que, em mamíferos, é irreversível¹⁰.

Terapias de substituição celular têm sido propostas que podem reparar tais danos^11,12. A abordagem desta pesquisa tem sido compreender o desenvolvimento normal da célula ciliada de mamíferos e perguntar se os programas de desenvolvimento podem ser reiniciados em células semelhantes a progenitores que possam existir dentro da orelha interna¹³. Uma segunda abordagem tem sido olhar para fora dos mamíferos, para vertebrados não mamíferos nos quais ocorre regeneração robusta das células ciliadas auditivas, como as aves^14,15. Em aves, a regeneração das células ciliadas ocorre predominantemente através da desdiferenciação de uma célula de suporte para um estado semelhante ao de progenitor, seguida de divisão mitótica assimétrica para gerar uma célula ciliada e uma célula de suporte¹⁶. Além disso, a diferenciação direta de uma célula de suporte para gerar uma célula ciliada também tem sido observada¹⁷.

Embora os mecanismos de desenvolvimento auditivo aviário mostrem semelhanças significativas com os dos mamíferos, existem diferenças¹⁸. A diferenciação de HC e SC na PA do pintinho é aparente a partir do dia embrionário (E) 7, tornando-se mais distinta ao longo do tempo. Por E12, uma papila basilar (PA) bem padronizada e bem polarizada pode ser visualizada, e por E17 células ciliadas bem desenvolvidas podem ser vistas¹⁹. Esses pontos de tempo fornecem janelas para os mecanismos de diferenciação, padronização e polaridade, bem como a maturação das células ciliadas. Entender se tais mecanismos são conservados ou divergentes é importante, pois eles fornecem insights sobre a homologia profunda das origens das células ciliadas mecanossensoriais.

Aqui, demonstramos uma série de técnicas realizadas em estágios embrionários iniciais e tardios para estudar processos celulares, como proliferação, especificação de destino, diferenciação, padronização e manutenção ao longo do desenvolvimento do órgão do ouvido interno. Isso complementa outros protocolos de compreensão do desenvolvimento da orelha interna em cultura de explante^20,21,22. Primeiro, discutimos a introdução de DNA ou RNA exógeno em precursores da PA dentro do otocisto E3.5 usando na ovo-eletroporação. Embora as manipulações genéticas possam fornecer informações valiosas, os fenótipos assim gerados podem ser pleiotrópicos e, consequentemente, confusos. Isto é particularmente verdadeiro durante o desenvolvimento posterior do ouvido interno, onde processos fundamentais, como o remodelamento citoesquelético, desempenham múltiplos papéis na divisão celular, morfogênese tecidual e especialização celular. Apresentamos protocolos de inibição farmacológica em explantes cultivados, que oferecem vantagens no controle da dosagem e do tempo e duração do tratamento, oferecendo manipulação espaço-temporal precisa dos mecanismos de desenvolvimento.

Diferentes métodos de cultura de órgãos podem ser utilizados, dependendo da duração do tratamento de pequenos inibidores. Aqui demonstramos dois métodos de cultura de órgãos que permitem insights sobre a morfogênese epitelial e a especialização celular. Um método para cultura 3D usando colágeno como matriz para cultivar o ducto coclear permite a cultura robusta e a visualização ao vivo da PA em desenvolvimento. Para a compreensão da formação de estereocílios, apresentamos um método de cultura de membrana de tal forma que o tecido epitelial seja cultivado em uma matriz rígida, permitindo que as saliências de actina cresçam livremente. Ambos os métodos permitem o processamento a jusante, como imagens de células vivas, imuno-histoquímica, microscopia eletrônica de varredura (MEV), gravação celular, etc. Essas técnicas fornecem um roteiro para o uso efetivo do pintinho como um sistema modelo para entender e manipular o desenvolvimento, maturação e regeneração do epitélio auditivo aviário.

Protocol

Protocolos envolvendo a aquisição, cultura e uso de ovos de galinha fertilizados e embriões não eclodidos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal Institucional do Centro Nacional de Ciências Biológicas, Bengaluru, Karnataka. 1. Na eletroporação de ovoporação de precursores auditivos de pintos Projeto de sgRNA e clonagem para knockout do gene CRISPR/Cas9Para criar nocautes de genes, o projeto guia RNAs para interromper as regiões éxo…

Representative Results

Na configuração de eletroporação, o posicionamento do eletrodo pode desempenhar um papel no domínio da transfecção. O eletrodo positivo é colocado sob a gema e o negativo acima do embrião (Figura 1A). Isso resulta em maior expressão de GFP em grande parte da orelha interna e em ambos os órgãos vestibulares (Figura 1B) e na papila basilar auditiva (Figura 1C,D), confirmando a transfecção. <p class="…

Discussion

O pintinho é uma adição econômica e conveniente aos organismos modelo que um laboratório pode usar para pesquisar o ouvido interno. Os métodos descritos aqui são rotineiramente usados em nosso laboratório e complementam a pesquisa em andamento no ouvido interno dos mamíferos. No ovo, a eletroporação é usada para introduzir manipulações genéticas no genoma do pintinho. A eletroporação também pode ser usada para introduzir construtos que codificam proteínas fluorescentes direcionadas a organelas…

Materials

Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22287
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3	Integrated DNA Technologies	1081061	High fidelity Cas9 protein
Anti-GFP antibody	Abcam	ab290	Rabbit polyclonal to GFP
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Calcium Chloride Dihydrate	Thermo Fisher Scientific	Q12135
Collagen I, rat tail	Thermo Fisher Scientific	A1048301
Critical Point Dryer Leica EM CPD300	Leica
CUY-21 Electroporator	Nepagene
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DM5000B Widefield Microscope	Leica
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	10569010
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252
Fluoroshield	Sigma-Aldrich	F6182
FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope	Olympus
Glutaraldehyde (25 %)	Sigma-Aldrich	340855
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11001
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11008
Goat Serum Sterile filtered	HiMedia	RM10701	Heat inactivated
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	14025092
LSM980 Airyscan Microscope	Zeiss
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm	Sigma-Aldrich	PICM03050
MVX10 Stereo Microscope	Olympus
MYO7A antibody	DSHB	138-1	Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa
MZ16 Dissecting microscope	Leica
N-2 Supplement (100X)	Thermo Fisher Scientific	17502048
Noyes Scissors, 14cm (5.5'')	World Precision Instruments	501237
Osmium tetroxide (4%)	Sigma-Aldrich	75632
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PC-10 Puller	Narishige
pcU6_1sgRNA	Addgene	92395	Mini vector with modified chicken U6 promoter
Penicillin G sodium salt	Sigma-Aldrich	P3032
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36934
SMZ1500 Dissecting microscope	Nikon
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M	Electron Microscopy Sciences	11652
Sodium chloride	HiMedia	GRM853
Sputtre Coater K550X	Emitech
Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament	World Precision Instruments	1B100-3
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097
The MERLIN Compact VP	Zeiss
Thiocarbohydrazide	Alfa Aesar	L01205
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379