Explorando mutações da caspase e modificação pós-translacional por abordagens de modelagem molecular

Summary

O presente protocolo utiliza um pacote de simulação biomolecular e descreve a abordagem de dinâmica molecular (MD) para modelar a caspase do tipo selvagem e suas formas mutantes. O método MD permite avaliar a evolução dinâmica da estrutura da caspase e o efeito potencial de mutações ou modificações pós-traducionais.

Abstract

A apoptose é um tipo de morte celular programada que elimina células danificadas e controla o desenvolvimento e a homeostase tecidual de organismos multicelulares. Caspases, uma família de proteases de cisteína, desempenham um papel fundamental na iniciação e execução da apoptose. A maturação das caspases e sua atividade é ajustada por modificações pós-traducionais de forma altamente dinâmica. Para avaliar o efeito das alterações pós-translacionais, os locais potenciais são rotineiramente mutados com resíduos persistentes a quaisquer modificações. Por exemplo, o resíduo de serina é substituído por alanina ou ácido aspártico. No entanto, tais substituições poderiam alterar a conformação do sítio ativo da caspase, levando a distúrbios na atividade catalítica e nas funções celulares. Além disso, mutações de outros resíduos de aminoácidos localizados em posições críticas também podem quebrar a estrutura e as funções das caspases e levar à perturbação da apoptose. Para evitar as dificuldades de empregar resíduos mutantes, abordagens de modelagem molecular podem ser prontamente aplicadas para estimar o efeito potencial das substituições de aminoácidos na estrutura da caspase. O presente protocolo permite a modelagem tanto da caspase do tipo selvagem quanto de suas formas mutantes com o pacote de simulação biomolecular (Amber) e instalações de supercomputador para testar o efeito de mutações na estrutura e função da proteína.

Introduction

A apoptose é um dos processos celulares mais amplamente estudados que regulam a morfogênese e a homeostase tecidual de organismos multicelulares. A apoptose pode ser iniciada por uma ampla gama de estímulos externos ou internos, como a ativação de receptores de morte, distúrbios nos sinais do ciclo celular, danos ao DNA, estresse do retículo endoplasmático (RE) e várias infecções bacterianas e virais¹. As caspases – principais atores apoptóticos – são convencionalmente classificadas em dois grupos: iniciadores (caspase-2, caspase-8, caspase-9 e caspase-10) e efetores (caspase-3, caspase-6 e caspase-7), dependendo de sua estrutura de domínio e do lugar na cascata da caspase ^2,3. Após os sinais de morte celular, as caspases iniciadoras interagem com moléculas adaptadoras que facilitam a dimerização induzida pela proximidade e o autoprocessamento para formar uma enzima ativa. As caspases efetoras são ativadas através de clivagem por caspases iniciadoras e realizam etapas de execução a jusante por clivagem múltiplos substratos celulares⁴.

A maturação e a função das caspases iniciadora e efetora são reguladas por um grande número de diferentes mecanismos intracelulares, dentre os quais a modificação pós-translacional desempenha um papel indispensável na modulação da morte celular⁵. A adição de grupos modificadores (fosforilação, nitrosilação, metilação ou acetilação) ou proteínas (ubiquitinação ou SUMOilação) altera a atividade enzimática das caspases ou a conformação e estabilidade proteica que regulam a apoptose. A mutagênese dirigida ao site é amplamente aplicada para investigar os possíveis locais de modificação pós-translacional e discernir seu papel. Um suposto local de modificação é geralmente substituído por outro aminoácido, que não pode ser modificado ainda mais. Assim, serina e treonina potencialmente fosforiladas são mutadas para alanina, e os locais de ubiquitinação de lisina são substituídos por arginina. Outra estratégia inclui a substituição de um aminoácido que imita particularmente a modificação pós-translacional (por exemplo, glutamato e aspartato têm sido usados para imitar serina fosforilada ou treonina)⁶. No entanto, algumas dessas substituições localizadas na alta vizinhança de um sítio ativo ou em posições críticas podem alterar a estrutura da caspase, perturbar a atividade catalítica e suprimir a morte celular apoptótica⁷. Efeitos semelhantes podem ser observados em casos de mutações missense associadas a tumores em genes caspase. Por exemplo, a mutação tumoral associada à caspase-6 – R259H – resultou em alterações conformacionais de alças na bolsa de ligação ao substrato, reduzindo o eficiente turnover catalítico dos substratos⁸. A substituição do aminoácido G325A na caspase-8 identificada no carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço poderia dificultar a atividade da caspase-8, o que levou à modulação da sinalização do fator nuclear kB (NF-kB) e promoveu a tumorigênese⁹.

Para avaliar o efeito potencial das substituições de aminoácidos na estrutura e função da caspase, a modelagem molecular pode ser aplicada. A abordagem da dinâmica molecular (MD) é descrita neste trabalho para modelar a caspase do tipo selvagem e suas formas mutantes usando o pacote de simulação biomolecular (Amber). O método MD fornece uma visão da evolução dinâmica da estrutura da proteína após a introdução de mutações. Originalmente desenvolvido pelo grupo de Peter Kollman, o pacote Amber tornou-se uma das ferramentas de software mais populares para simulações biomoleculares^10,11,12,13. Este software é dividido em duas partes: (1) AmberTools, uma coleção de programas rotineiramente utilizados para a preparação do sistema (atribuição de tipo de átomo, adição de hidrogênios e moléculas de água explícita, etc.) e análise de trajetória; e (2) Âmbar, que é centrado em torno do programa de simulação pmemd. O AmberTools é um pacote gratuito (e um pré-requisito para instalar o próprio Amber), enquanto o Amber é distribuído com uma estrutura separada de licenças e taxas. Simulações paralelas em um supercomputador e/ou utilizando unidades de processamento gráfico (GPUs) podem melhorar substancialmente o desempenho para a pesquisa científica da dinâmica da estrutura de proteínas¹⁴. As versões de software mais recentes disponíveis são AmberTools21 e Amber20, mas os protocolos descritos também podem ser usados com as versões anteriores.

Protocol

1. Preparação do sistema NOTA: Os modelos moleculares das formas proteicas nativas e mutantes são construídos com base em uma estrutura cristalina apropriada obtida do Protein Data Bank15,16. Para recuperar a estrutura PDB selecionada, use a lista suspensa Baixar arquivos e clique em Formato PDB. Remova comentários e dados de conectividade e insira um cartão TER entre c…

Representative Results

O presente protocolo pode ser prontamente aplicado em estudos de modificação pós-translacional de caspases ou mutações patogênicas. Nesta seção, é ilustrado o fluxo de trabalho de modelagem de DM (Figura 1), que tem sido utilizado com sucesso no estudo da caspase-27. Usando mutagênese in vitro direcionada ao local de potenciais sítios de fosforilação (Ser/Thr a Ala) e abordagens bioquímicas, demonstrou-se que a mutação Ser384Ala impediu o proc…

Discussion

A abordagem MD descrita permite modelar as formas selvagens e mutantes de caspase usando os pacotes de simulação biomolecular. Várias questões importantes da metodologia são discutidas aqui. Primeiro, uma estrutura cristalina representativa da caspase precisa ser selecionada do Banco de Dados de Proteínas. É importante ressaltar que as formas monomérica e dimérica de caspase são aceitáveis. Escolher estruturas de alta resolução com um número mínimo de resíduos ausentes é uma boa ideia. O estado de proton…

Materials

Amber20	University of California, San Francisco		Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org
AmberTools21	University of California, San Francisco		Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org