Explorando las mutaciones de caspasa y la modificación postraduccional mediante enfoques de modelado molecular
Summary
El presente protocolo utiliza un paquete de simulación biomolecular y describe el enfoque de dinámica molecular (DM) para modelar la caspasa de tipo salvaje y sus formas mutantes. El método MD permite evaluar la evolución dinámica de la estructura de la caspasa y el efecto potencial de mutaciones o modificaciones postraduccionales.
Abstract
La apoptosis es un tipo de muerte celular programada que elimina las células dañadas y controla el desarrollo y la homeostasis tisular de los organismos multicelulares. Las caspasas, una familia de proteasas de cisteína, juegan un papel clave en el inicio y ejecución de la apoptosis. La maduración de las caspasas y su actividad se ajusta mediante modificaciones postraduccionales de una manera altamente dinámica. Para evaluar el efecto de los cambios postraduccionales, los sitios potenciales se mutan rutinariamente con residuos persistentes a cualquier modificación. Por ejemplo, el residuo de serina se reemplaza con alanina o ácido aspártico. Sin embargo, tales sustituciones podrían alterar la conformación del sitio activo de la caspasa, lo que provocaría alteraciones en la actividad catalítica y las funciones celulares. Además, las mutaciones de otros residuos de aminoácidos localizados en posiciones críticas también podrían romper la estructura y las funciones de las caspasas y provocar perturbaciones en la apoptosis. Para evitar las dificultades de emplear residuos mutados, los enfoques de modelado molecular se pueden aplicar fácilmente para estimar el efecto potencial de las sustituciones de aminoácidos en la estructura de la caspasa. El presente protocolo permite el modelado tanto de la caspasa de tipo salvaje como de sus formas mutantes con el paquete de simulación biomolecular (Amber) y las instalaciones de supercomputadora para probar el efecto de las mutaciones en la estructura y función de la proteína.
Introduction
La apoptosis es uno de los procesos celulares más estudiados que regulan la morfogénesis y la homeostasis tisular de los organismos multicelulares. La apoptosis puede ser iniciada por una amplia gama de estímulos externos o internos, como la activación de los receptores de muerte, la alteración en las señales del ciclo celular, el daño del ADN, el estrés del retículo endoplásmico (RE) y diversas infecciones bacterianas y virales1. Las caspasas – actores apoptóticos clave – se clasifican convencionalmente en dos grupos: iniciadores (caspasa-2, caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-10) y efectores (caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7), dependiendo de su estructura de dominio y el lugar en la cascada de caspasas 2,3. Tras las señales de muerte celular, las caspasas iniciadoras interactúan con moléculas adaptadoras que facilitan la dimerización inducida por proximidad y el autoprocesamiento para formar una enzima activa. Las caspasas efectoras se activan a través de la escisión mediante caspasas iniciadoras y realizan pasos de ejecución aguas abajo al dividir múltiples sustratos celulares4.
La maduración y la función de las caspasas iniciadoras y efectoras están reguladas por un gran número de mecanismos intracelulares diferentes, entre los cuales la modificación post-traduccional juega un papel indispensable en la modulación de la muerte celular5. La adición de grupos modificadores (fosforilación, nitrosilación, metilación o acetilación) o proteínas (ubiquitinación o SUMOilación) cambia la actividad enzimática de las caspasas o la conformación y estabilidad de proteínas que regulan la apoptosis. La mutagénesis dirigida al sitio se aplica ampliamente para investigar los posibles sitios de modificación postraduccional y discernir su papel. Un sitio de modificación putativo generalmente se reemplaza por otro aminoácido, que no se puede modificar más. Por lo tanto, la serina y la treonina potencialmente fosforiladas se mutan a alanina, y los sitios de ubiquitinación de lisina se reemplazan con arginina. Otra estrategia incluye la sustitución de un aminoácido que imita particularmente la modificación postraduccional (por ejemplo, el glutamato y el aspartato se han utilizado para imitar la serina fosforilada o la treonina)6. Sin embargo, algunas de estas sustituciones localizadas en las altas proximidades de un sitio activo o en posiciones críticas podrían cambiar la estructura de la caspasa, perturbar la actividad catalítica y suprimir la muerte celular apoptótica7. Se pudieron observar efectos similares en casos de mutaciones sin sentido asociadas a tumores en genes de caspasa. Por ejemplo, la mutación asociada al tumor de la caspasa-6 – R259H – resultó en cambios conformacionales de bucles en el bolsillo de unión al sustrato, reduciendo el recambio catalítico eficiente de los sustratos8. La sustitución de aminoácidos G325A en la caspasa-8 identificada en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello podría obstaculizar la actividad de la caspasa-8, lo que condujo a la modulación de la señalización del factor nuclear kB (NF-kB) y promovió la tumorigénesis9.
Para evaluar el efecto potencial de las sustituciones de aminoácidos en la estructura y función de la caspasa, se puede aplicar el modelado molecular. El enfoque de dinámica molecular (MD) se describe en este trabajo para modelar la caspasa de tipo salvaje y sus formas mutantes utilizando el paquete de simulación biomolecular (Amber). El método MD ofrece una visión de la evolución dinámica de la estructura de la proteína tras la introducción de mutaciones. Originalmente desarrollado por el grupo de Peter Kollman, el paquete Amber se convirtió en una de las herramientas de software más populares para simulaciones biomoleculares10,11,12,13. Este software se divide en dos partes: (1) AmberTools, una colección de programas utilizados rutinariamente para la preparación del sistema (asignación de tipo átomo, adición de hidrógenos y moléculas de agua explícita, etc.) y análisis de trayectoria; y (2) Amber, que se centra en el programa de simulación pemdd. AmberTools es un paquete gratuito (y un requisito previo para instalar Amber), mientras que Amber se distribuye con una licencia separada y una estructura de tarifas. Las simulaciones paralelas en un superordenador y/o utilizando unidades de procesamiento gráfico (GPU) pueden mejorar sustancialmente el rendimiento para la investigación científica de la dinámica de la estructura de proteínas14. Las últimas versiones de software disponibles son AmberTools21 y Amber20, pero los protocolos descritos también se pueden utilizar con las versiones anteriores.
Protocol
Representative Results
Discussion
El enfoque MD descrito permite modelar tanto las formas de caspasa de tipo salvaje como mutantes utilizando los paquetes de simulación biomolecular. Aquí se discuten varias cuestiones importantes de la metodología. Primero, se debe seleccionar una estructura cristalina representativa de caspasa del Banco de Datos de Proteínas. Es importante destacar que tanto las formas monoméricas como las diméricas de caspasa son aceptables. Elegir estructuras de alta resolución con un número mínimo de residuos faltantes es un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Rusa de Ciencias (17-75-20102, el desarrollo del protocolo). Los experimentos descritos en la sección de resultados representativos (análisis de la fosforilación) fueron apoyados por las Sociedades del Cáncer de Estocolmo (181301) y Suecia (190345).
Materials
| Amber20 | University of California, San Francisco | Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org |
|
| AmberTools21 | University of California, San Francisco | Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org |
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