Edições de knock-in precisas mediadas por CRISPR-Cas9 em corações de peixe-zebra
Summary
Este protocolo descreve uma abordagem para facilitar edições precisas em embriões de peixe-zebra usando a tecnologia CRISPR-Cas9. Um pipeline de fenotipagem é apresentado para demonstrar a aplicabilidade dessas técnicas para modelar uma variante gênica associada à Síndrome do QT Longo.
Abstract
Repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) em modelos animais permitem manipulação genética precisa para o estudo de fenômenos fisiológicos. O peixe-zebra tem sido usado como um modelo genético eficaz para estudar inúmeras questões relacionadas a doenças hereditárias, desenvolvimento e toxicologia no nível de todo o órgão e organismo. Devido ao genoma do peixe-zebra bem anotado e mapeado, inúmeras ferramentas para edição de genes foram desenvolvidas. No entanto, a eficácia de gerar e a facilidade de detectar edições precisas usando CRISPR é um fator limitante. Descrita aqui está uma abordagem knock-in baseada em CRISPR-Cas9 com a simples detecção de edições precisas em um gene responsável pela repolarização cardíaca e associado ao distúrbio elétrico, Síndrome do QT Longo (SQTL). Esta abordagem de RNA de guia único (sgRNA) extirpa e substitui a sequência alvo e liga um gene repórter geneticamente codificado. A utilidade dessa abordagem é demonstrada pela descrição de medidas fenotípicas não invasivas da função elétrica cardíaca em larvas de peixe-zebra do tipo selvagem e editadas por genes. Esta abordagem permite o estudo eficiente de variantes associadas à doença em todo um organismo. Além disso, essa estratégia oferece possibilidades para a inserção de sequências exógenas de escolha, como genes repórteres, ortólogos ou editores de genes.
Introduction
As estratégias de edição de genes baseadas em CRISPR em modelos animais permitem o estudo de doenças, desenvolvimento e toxicologia geneticamente hereditárias no nível de todo o organismo 1,2,3. O peixe-zebra fornece um modelo poderoso que está mais próximo em numerosos aspectos fisiológicos dos seres humanos do que os modelos celulares murinos ou derivados de humanos4. Uma extensa gama de ferramentas e estratégias genéticas tem sido usada no peixe-zebra tanto para triagem genética direta5 quanto reversa6. O mapeamento genético abrangente e a anotação em peixes-zebra facilitaram abordagens de edição de genes como uma técnica primária para projetar knockouts de genes direcionados (KOs) e knock-ins precisos (KIs)7.
Apesar disso, a geração de edições precisas de KI no peixe-zebra é limitada pela baixa eficiência e pela dificuldade de detecção precisa. Embora as nucleases efetoras semelhantes a fatores de transcrição (TALENs) tenham sido usadas e otimizadas com sucesso para KIs8, o CRISPR fornece uma estratégia aprimorada de edição de genes com direcionamento de sgRNA mais simples. Numerosos estudos têm utilizado a CRISPR para gerar KIs precisas em peixes-zebra 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, embora essas edições geradas através do reparo dirigido por homologia (HDR) mediado por CRISPR tendam a ser ineficientes com baixo sucesso intrínseco taxas que requerem genotipagem como tela primária 9,10,14,21. Isso demonstra a necessidade de um sistema KI CRISPR eficiente em peixe-zebra, bem como um sistema confiável de alto rendimento para detectar edições precisas.
O objetivo deste estudo foi descrever uma plataforma para gerar um gene KI cardíaco preciso em corações de peixe-zebra com detecção simples e de alto rendimento de edições bem-sucedidas. Uma abordagem de substituição de éxons de dois sgRNA baseada em CRISPR-Cas9 é descrita, que é baseada em uma abordagem TALEN8. Essa abordagem envolve a excisão da sequência alvo usando guias de dois sgRNA e a substituição por uma sequência de modelo exógena que contém o KI de interesse, bem como um gene repórter intrônico geneticamente codificado (Figura 1). A integração de um repórter fluorescente geneticamente codificado dentro da sequência intrônica do gene alvo permite a detecção eficiente de edições positivas. Uma plataforma de fenotipagem é então descrita para avaliar a função elétrica cardíaca em larvas de peixe-zebra para caracterização não invasiva das variantes genéticas associadas à SQTL hereditária, um distúrbio elétrico cardíaco que predispõe os indivíduos à morte súbita cardíaca.
Essas abordagens aumentarão o acesso e o uso de edições do gene KI do peixe-zebra para modelar doenças hereditárias e abordar questões biológicas e fisiológicas, como o mapeamento de padrões de expressão gênica e a regulação do desenvolvimento. Como os corações de peixe-zebra são mais paralelos às características eletrofisiológicas cardíacas humanas do que os modelos murinos, eles podem ser particularmente atraentes como um sistema geneticamente tratável para modelagem de doenças cardíacas 7,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
A engenharia de edições precisas de genes usando CRISPR-Cas9 é desafiada pela baixa eficiência dos mecanismos HDR e sua detecção eficiente. Aqui, uma abordagem de substituição de éxons de dois sgRNA baseada em CRISPR-Cas9 é descrita que produz edições precisas em peixes-zebra com detecção visual direta de edições positivas. A eficácia desta abordagem é demonstrada através da geração de edições precisas no gene zkcnh6a . Este trabalho mostra como a função cardíaca em larvas de peixe-zebr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa do Canadian Institutes of Health Research Project (T.W.C.) e pelas bolsas do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá Discovery (T.W.C.).
Materials
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
References
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