CRISPR-Cas9-medierede præcise knock-in-redigeringer i zebrafiskehjerter
Summary
Denne protokol beskriver en tilgang til at lette præcise knock-in-redigeringer i zebrafiskembryoner ved hjælp af CRISPR-Cas9-teknologi. En fænotypningsrørledning præsenteres for at demonstrere anvendeligheden af disse teknikker til at modellere en lang QT-syndrom-associeret genvariant.
Abstract
Grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) i dyremodeller muliggør præcis genetisk manipulation til undersøgelse af fysiologiske fænomener. Zebrafisk er blevet brugt som en effektiv genetisk model til at studere adskillige spørgsmål relateret til arvelig sygdom, udvikling og toksikologi på helorgan- og -organismeniveau. På grund af det velannoterede og kortlagte zebrafiskgenom er der udviklet adskillige værktøjer til genredigering. Imidlertid er effektiviteten af at generere og let at opdage præcise knock-in-redigeringer ved hjælp af CRISPR en begrænsende faktor. Beskrevet her er en CRISPR-Cas9-baseret knock-in tilgang med simpel påvisning af præcise redigeringer i et gen, der er ansvarlig for hjerterepolarisering og forbundet med den elektriske lidelse, Long QT Syndrome (LQTS). Denne to-single-guide RNA (sgRNA) tilgang punktafgifter og erstatter målsekvensen og forbinder et genetisk kodet reportergen. Nytten af denne tilgang demonstreres ved at beskrive ikke-invasive fænotypiske målinger af hjerteelektrisk funktion i vildtype- og genredigerede zebrafisklarver. Denne tilgang muliggør effektiv undersøgelse af sygdomsassocierede varianter i en hel organisme. Desuden giver denne strategi muligheder for indsættelse af eksogene sekvenser efter eget valg, såsom reportergener, ortologer eller genredaktører.
Introduction
CRISPR-baserede genredigeringsstrategier i dyremodeller muliggør undersøgelse af genetisk arvelig sygdom, udvikling og toksikologi på hele organismeniveau 1,2,3. Zebrafisk giver en kraftfuld model, der i mange fysiologiske aspekter er tættere på mennesker end murine eller humanafledte cellemodeller4. En bred vifte af genetiske værktøjer og strategier er blevet brugt i zebrafisk til både fremad5 og omvendt genetisk screening6. Omfattende genetisk kortlægning og annotering i zebrafisk har lettet genredigeringsmetoder som en primær teknik til at konstruere målrettede gen-knockouts (KO’er) og præcise knock-ins (KI’er)7.
På trods af dette er generering af præcise KI-redigeringer i zebrafisk begrænset af lav effektivitet og vanskeligheden ved nøjagtig detektion. Selvom transkriptionsfaktorlignende effektornukleaser (TALEN’er) med succes er blevet brugt og optimeret til KIs8, giver CRISPR en forbedret genredigeringsstrategi med enklere sgRNA-målretning. Talrige undersøgelser har brugt CRISPR til at generere præcise KI’er i zebrafisk 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, selvom disse redigeringer genereret gennem CRISPR-medieret homologi-rettet reparation (HDR) har tendens til at være ineffektive med lav iboende succes satser, der kræver genotypning som en primær skærm 9,10,14,21. Dette viser behovet for et effektivt KI CRISPR-system i zebrafisk samt et pålideligt system med høj kapacitet til at detektere præcise redigeringer.
Målet med denne undersøgelse var at beskrive en platform til generering af et præcist hjertegen KI i zebrafiskhjerter med enkel og høj gennemstrømning af vellykkede redigeringer. En CRISPR-Cas9-baseret to-sgRNA exon udskiftningsmetode er beskrevet, som er baseret på en TALEN tilgang8. Denne fremgangsmåde indebærer udskæring af målsekvensen ved hjælp af to-sgRNA-guider og udskiftning med en eksogen skabelonsekvens, der indeholder KI af interesse samt et genetisk kodet intronic reporter-gen (figur 1). Integrationen af en genetisk kodet fluorescerende reporter i målgenet intronic-sekvensen muliggør effektiv påvisning af positive redigeringer. En fænotypeplatform beskrives derefter til vurdering af hjerteelektrisk funktion i zebrafisklarver til ikke-invasiv karakterisering af genvarianterne forbundet med arvelig LQTS, en hjerteelektrisk lidelse, der prædisponerer individer for pludselig hjertedød.
Disse tilgange vil forbedre adgangen til og brugen af zebrafisk KI-genredigeringer til at modellere arvelige sygdomme og adressere biologiske og fysiologiske spørgsmål, såsom kortlægning af genekspressionsmønstre og udviklingsregulering. Da zebrafiskhjerter bedre parallelle menneskelige hjerteelektrofysiologiske egenskaber end murinmodeller, kan de være særligt attraktive som et genetisk medgørligt system til modellering af hjertesygdomme 7,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Konstruktionen af præcise genredigeringer ved hjælp af CRISPR-Cas9 udfordres af den lave effektivitet af HDR-mekanismer og deres effektive detektion. Her beskrives en CRISPR-Cas9-baseret to-sgRNA exon-erstatningsmetode, der producerer præcise redigeringer i zebrafisk med ligefrem visuel påvisning af positive redigeringer. Effekten af denne tilgang demonstreres ved at generere præcise redigeringer i zkcnh6a-genet . Dette papir viser, hvordan hjertefunktion i genredigerede zebrafisklarver kan vurderes ved hj?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af et canadisk institut for sundhedsforskningsprojekttilskud (T.W.C.) og Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery-tilskud (T.W.C.).
Materials
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
References
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models. Animal Cells and Systems. 24 (1), 8-16 (2020).
- Li, Q., et al. Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 689-698 (2019).
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little fish, big data: Zebrafish as a model for cardiovascular and metabolic disease. Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).
- Kegel, L., et al. Forward genetic screen using zebrafish to identify new genes involved in myelination. Oligodendrocytes: Methods and Protocols. 1936, 185-209 (2019).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- González-Rosa, J. M. Zebrafish models of cardiac disease: From fortuitous mutants to precision medicine. Circulation Research. 130 (12), 1803-1826 (2022).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise editing of the Zebrafish genome made simple and efficient. Developmental Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Albadri, S., Del Bene, F., Revenu, C. Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish. Methods. 121-122, 77-85 (2017).
- Armstrong, G. A. B., et al. Homology directed knockin of point mutations in the zebrafish tardbp and fus genes in ALS using the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 11 (3), 0150188 (2016).
- Bai, H., et al. CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish. BMC Genomics. 21 (1), 67 (2020).
- de Vrieze, E., et al. Efficient generation of knock-in zebrafish models for inherited disorders using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9429 (2021).
- Eschstruth, A., Schneider-Maunoury, S., Giudicelli, F. Creation of zebrafish knock-in reporter lines in the nefma gene by Cas9-mediated homologous recombination. Genesis. 58 (1), 23340 (2020).
- Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4 (1), 6545 (2014).
- Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions. Development. 148 (19), (2021).
- Prykhozhij, S. V., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Research. 46 (17), 102 (2018).
- Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. eLife. 9, 53968 (2020).
- Boel, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing. The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).
- Vornanen, M., Hassinen, M. Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology. Channels. 10 (2), 101-110 (2016).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Precipitation of Large RNAs with Lithium Chloride. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 3. E.15. , (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Agarose Gel Electrophoresis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 1. , 3-20 (1989).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Tanaka, Y., et al. Functional analysis of KCNH2 gene mutations of type 2 long QT syndrome in larval zebrafish using microscopy and electrocardiography. Heart and Vessels. 34 (1), 159-166 (2019).
- Dhillon, S. S., et al. Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs. PLoS One. 8 (4), 60552 (2013).
- Yu, F., et al. Evolving cardiac conduction phenotypes in developing zebrafish larvae: Implications to drug sensitivity. Zebrafish. 7 (4), 325-331 (2010).
- Hurst, R. M. . Development and optimization of tools for embryonic electrocardiograph recording for heart dysfunction in zebrafish. , (2018).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. BioTechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107 (10), 1355-1358 (2003).
- Langheinrich, U., Vacun, G., Wagner, T. Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia. Toxicology and Applied Pharmacology. 193 (3), 370-382 (2003).
- MacRae, C. A. Cardiac arrhythmia: In vivo screening in the zebrafish to overcome complexity in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (7), 619-632 (2010).
