CRISPR-Cas9-vermittelte präzise Knock-In-Bearbeitungen in Zebrafischherzen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz, um präzise Knock-in-Bearbeitungen in Zebrafischembryonen mit der CRISPR-Cas9-Technologie zu ermöglichen. Eine Phänotypisierungspipeline wird vorgestellt, um die Anwendbarkeit dieser Techniken zur Modellierung einer Long-QT-Syndrom-assoziierten Genvariante zu demonstrieren.
Abstract
Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) in Tiermodellen ermöglichen eine präzise genetische Manipulation zur Untersuchung physiologischer Phänomene. Zebrafische wurden als effektives genetisches Modell verwendet, um zahlreiche Fragen im Zusammenhang mit Erbkrankheiten, Entwicklung und Toxikologie auf der Ebene des gesamten Organs und des Organismus zu untersuchen. Aufgrund des gut annotierten und kartierten Zebrafischgenoms wurden zahlreiche Werkzeuge zur Gen-Editierung entwickelt. Die Wirksamkeit der Erzeugung und Leichtigkeit der Erkennung präziser Knock-In-Bearbeitungen mit CRISPR ist jedoch ein limitierender Faktor. Hier wird ein CRISPR-Cas9-basierter Knock-in-Ansatz mit dem einfachen Nachweis präziser Schnitte in einem Gen beschrieben, das für die kardiale Repolarisation verantwortlich ist und mit der elektrischen Störung Long QT Syndrome (LQTS) assoziiert ist. Dieser Zwei-Single-Guide-RNA-Ansatz (sgRNA) schneidet und ersetzt die Zielsequenz und verknüpft ein genetisch kodiertes Reportergen. Der Nutzen dieses Ansatzes wird durch die Beschreibung nicht-invasiver phänotypischer Messungen der kardialen elektrischen Funktion in Wildtyp- und geneditierten Zebrafischlarven demonstriert. Dieser Ansatz ermöglicht die effiziente Untersuchung krankheitsassoziierter Varianten in einem ganzen Organismus. Darüber hinaus bietet diese Strategie Möglichkeiten zum Einfügen exogener Sequenzen der Wahl, wie Reportergene, Orthologe oder Geneditoren.
Introduction
CRISPR-basierte Gen-Editing-Strategien in Tiermodellen ermöglichen die Untersuchung genetisch vererbbarer Erkrankungen, Entwicklung und Toxikologie auf der Ebene des gesamten Organismus 1,2,3. Zebrafische bieten ein leistungsfähiges Modell, das in zahlreichen physiologischen Aspekten dem Menschen näher ist als murine oder humane Zellmodelle4. Eine breite Palette genetischer Werkzeuge und Strategien wurde im Zebrafisch sowohl für das Vorwärts-als auch für das umgekehrte genetische Screening6 verwendet. Umfassende genetische Kartierung und Annotation bei Zebrafischen haben Gen-Editing-Ansätze als primäre Technik zur Entwicklung gezielter Gen-Knockouts (KOs) und präziser Knock-Ins (KIs) erleichtert7.
Trotzdem ist die Erzeugung präziser KI-Bearbeitungen im Zebrafisch durch geringe Effizienz und die Schwierigkeit einer genauen Erkennung begrenzt. Obwohl Transkriptionsfaktor-ähnliche Effektornukleasen (TALENs) erfolgreich für KIs8 eingesetzt und optimiert wurden, bietet CRISPR eine verbesserte Gen-Editing-Strategie mit einfacherem sgRNA-Targeting. Zahlreiche Studien haben CRISPR verwendet, um präzise KIs im Zebrafisch 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 zu erzeugen, obwohl diese Bearbeitungen, die durch CRISPR-vermittelte homologiegesteuerte Reparatur (HDR) erzeugt werden, tendenziell ineffizient mit geringem intrinsischem Erfolg sind. Raten, die eine Genotypisierung als primärer Screen erfordern 9,10,14,21. Dies zeigt die Notwendigkeit eines effizienten KI CRISPR-Systems im Zebrafisch sowie eines zuverlässigen Hochdurchsatzsystems zur Erkennung präziser Bearbeitungen.
Das Ziel dieser Studie war es, eine Plattform zur Erzeugung eines präzisen kardialen Gens KI in Zebrafischherzen mit einfacher und hochdurchsatzartiger Detektion erfolgreicher Bearbeitungen zu beschreiben. Es wird ein CRISPR-Cas9-basierter Zwei-sgRNA-Exonersatzansatz beschrieben, der auf einem TALEN-Ansatz8 basiert. Dieser Ansatz beinhaltet die Exzision der Zielsequenz unter Verwendung von Zwei-sgRNA-Guides und den Ersatz durch eine exogene Vorlagensequenz, die die interessierende KI sowie ein genetisch kodiertes intronisches Reportergen enthält (Abbildung 1). Die Integration eines genetisch kodierten fluoreszierenden Reporters in die intronische Zielgensequenz ermöglicht die effiziente Detektion positiver Edits. Anschließend wird eine Phänotypisierungsplattform zur Beurteilung der kardialen elektrischen Funktion in Zebrafischlarven zur nicht-invasiven Charakterisierung der Genvarianten beschrieben, die mit vererbtem LQTS assoziiert sind, einer kardialen elektrischen Störung, die Personen für den plötzlichen Herztod prädisponiert.
Diese Ansätze werden den Zugang zu und die Nutzung von Zebrafisch-KI-Genbearbeitungen verbessern, um Erbkrankheiten zu modellieren und biologische und physiologische Fragen wie die Kartierung von Genexpressionsmustern und die Entwicklungsregulation anzugehen. Da Zebrafischherzen bessere parallele humane kardiale elektrophysiologische Eigenschaften aufweisen als Mausmodelle, können sie als genetisch beherrschbares System für die Modellierung von Herzerkrankungen besonders attraktiv sein 7,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Entwicklung präziser Genbearbeitungen mit CRISPR-Cas9 wird durch die geringe Effizienz von HDR-Mechanismen und deren effiziente Detektion herausgefordert. Hier wird ein CRISPR-Cas9-basierter Zwei-sgRNA-Exonersatzansatz beschrieben, der präzise Schnitte im Zebrafisch mit einfacher visueller Erkennung positiver Bearbeitungen erzeugt. Die Wirksamkeit dieses Ansatzes wird durch die Erzeugung präziser Bearbeitungen im zkcnh6a-Gen nachgewiesen. Diese Arbeit zeigt, wie die Herzfunktion in geneditierten Zebrafisc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch ein Canadian Institutes of Health Research Project Grant (T.W.C.) und Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants (T.W.C.) unterstützt.
Materials
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
References
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